Développement de modèles d'infection de cellules neurales équines par des arbovirus neurotropes et contribution à l'identification de molécules antivirales pour le traitement des encéphalites équines à virus West Nile

Development of equine brain cell infection models by neurotropic arboviruses and contribution to the identification of antiviral molecules for the treatment of West Nile virus encephalitis in horses.

• Auteur / Autrice : Marielle Bernoin
• Direction : Muriel Coulpier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 09/06/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Virologie (Maisons-Alfort, Val-de-Marne)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Santé et médicament (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Stéphane Biacchesi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Fabienne Archer, Stéphane Pronost, Gaëlle Gonzalez
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Fabienne Archer, Stéphane Pronost

Mots clés

Mots clés contrôlés

Arbovirus

Cellules souches neurales

Équidés

Antiviraux

Virus West Nile

Encéphalite

Mots clés libres

Encéphalites

Virus

Antiviraux

Équin

Cellules neurales

Imagerie cellulaire

Encephalitis

Virus

Antiviral

Equine

Neural cells

Cell imaging

Résumé

Les encéphalites virales équines sont une préoccupation pour la filière équine (cinquième cause de mortalité) et représentent une menace sanitaire et économique importante pour celle-ci. Parmi les virus en cause : le virus West Nile (WNV). Il s'agit d'un arbovirus de la famille des Flaviviridae, genre Flavivirus, transmis par les moustiques et responsable d'encéphalites pouvant être fatales ou conduisant à de graves séquelles neurologiques chez le cheval mais aussi chez l'homme. Le WNV est actuellement endémique sur tous les continents ; il voit sa zone de distribution s'étendre en Europe et depuis une vingtaine d'année, il est considéré comme un virus ré-émergent. Chez le cheval, bien que des vaccins soient disponibles, la couverture vaccinale est faible et aucun traitement thérapeutique n'est disponible. Dans ce contexte, l'objectif de cette thèse était d'identifier des molécules antivirales pouvant bloquer la réplication du WNV dans le cerveau des chevaux.Ces dernières années, de nombreuses études ont visé à identifier des molécules antivirales. Mais pour beaucoup, des modèles cellulaires peu pertinents physiologiquement (lignées cellulaires humaines par exemple) ont été utilisés. Les résultats obtenus peuvent ainsi, ne pas être transposables aux cellules du système nerveux des chevaux. Aussi, pour être en mesure d'identifier des molécules présentant un plus fort potentiel antiviral dans le système nerveux des équidés, notre premier objectif a été de développer un modèle cellulaire d'infection par WNV, basé sur des cellules neurales équines dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Grâce à ce nouveau modèle, nous avons pu réaliser notre second objectif : un crible phénotypique d'une petite banque de 45 molécules sélectionnées. Ce crible a révélé que des molécules, déjà connues pour bloquer la réplication de WNV dans d'autres modèles, se comportaient, soit de la même manière dans les cellules neurales équines (cas du 2'CMC), soit au contraire, qu'elles n'avaient aucune activité antivirale dans ces cellules (cas du favipiravir et sofosbuvir) ou encore, de façon étonnante, qu'elles avaient un rôle opposé à celui attendu (cas des statines). Ces derniers résultats nous ont conduits à initier une recherche visant à comprendre les mécanismes sous-tendant des rôles opposés dans des cellules d'origine humaine ou équine.Avec pour objectif d'être en mesure d'identifier des molécules antivirales à large spectre, nous avons également initié des premiers travaux avec le virus de l'encéphalite équine de l'est (EEEV). Cet autre arbovirus neurotrope zoonotique responsable d'encéphalites mortelles chez l'homme et les équidés, appartient à la famille des Togaviridae, genre Alphavirus. Il est présent exclusivement sur le continent américain à l'heure actuelle. Nos résultats ont montré que les cellules neurales progénitrices équines (eNPC) sont fortement permissives à EEEV fournissant un nouveau modèle d'infection qui pourra être utilisé à l'avenir pour tester le potentiel antiviral de petites molécules.Ce travail a donc permis 1/de mettre en place deux nouveaux modèles d'infection par des arbovirus équins appartenant à deux familles différentes (WNV et EEEV), 2/de développer des tests automatisés en microplaques basés sur de l'imagerie cellulaire et 3/de confirmer ou d'infirmer le rôle antiviral, dans des cellules du système nerveux des équidés, de molécules sélectionnées. Nos résultats ont également souligné l'importance d'utiliser des modèles in vitro physiologiquement pertinents pour évaluer le potentiel antiviral des molécules.

Equine viral encephalitis are of great concern for the equine industry (fifth cause of mortality) and represent a significant health and economic threat for the industry. Among the viruses involved is the West Nile virus (WNV). It is an arbovirus of the Flaviviridae family, genus Flavivirus, transmitted by mosquitoes and responsible for encephalitis that can be fatal or lead to serious neurological sequelae in horses but also in humans. WNV is currently endemic on all continents; its distribution area is expanding in Europe and for the last twenty years, it is considered as a re-emerging virus. In horses, although vaccines are available, vaccination coverage is insufficient and no therapeutic treatment is available. In this context, the objective of this thesis was to identify antiviral molecules that could block WNV replication in the brain of horses.In recent years, many studies have aimed at identifying antiviral molecules. But for many of them, cell models with little physiological relevance (e.g. human cell lines) have been used. The results obtained may therefore not be transposable to cells of the equine nervous system. Therefore, in order to be able to identify molecules with a stronger antiviral potential in the equine brain, our first objective was to develop a cellular model of WNV infection, based on equine neural cells derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). With this new model, we were able to achieve our second objective: a phenotypic screen of a small library of 45 selected molecules. This screen revealed that molecules, already known to block WNV replication in other models, behaved either in the same way in equine neural cells (case of 2'CMC), or on the contrary, had no antiviral activity in these cells (case of favipiravir and sofosbuvir) or, surprisingly, had an opposite role to the one expected (case of statins). These last results led us to initiate a research that aimed at understanding the mechanisms underlying opposite roles in cells of human or equine origin.With the objective of being able to identify broad-spectrum antiviral molecules, we have also initiated a work with the Eastern Equine Encephalitis Virus (EEEV). This other zoonotic neurotropic arbovirus responsible for fatal encephalitis in humans and equids, belongs to the Togaviridae family, genus Alphavirus. It is present exclusively on the American continent at the moment. Our results showed that equin neural progenitor cells (eNPCs) are highly permissive to EEEV, providing a new model of infection that could be used in the future to test the antiviral potential of small molecules.This work has therefore allowed 1/the establishment of two new models of infection by equine arboviruses, belonging to two different families (WNV and EEEV), 2/ the development of automated microplate assays based on cell imaging and 3/to confirm or deny the antiviral role of selected molecules in equine brain cells. Our results also outlined the importance of using physiologically relevant in vitro models for evaluating the antiviral potential of molecules.