Caractérisation des modes de transport du glutathion vers le Réticulum Endoplasmique mammifère, et criblage chimique à la découverte de nouvelles molécules modulant son métabolisme

Characterizing transport modalities of glutathione towards the mammalian endoplasmic reticulum, and chemical screenings for the discovery of novel compounds modulating its metabolism

• Auteur / Autrice : Aurélie Rachet
• Direction : Agnès Delaunay-Moisan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 24/11/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Sophie Dupré-Crochet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-François Collet, Geneviève Dupont, Meng-Er Huang, Anna Babour
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-François Collet, Geneviève Dupont

Mots clés

Mots clés contrôlés

Criblage pharmacologique

Transport biologique

Glutathion

Oxydoréduction

Réticulum endoplasmique

Mots clés libres

Reticulum endoplasmique

Redox

Glutathion

Transport

Criblage chimique

Endoplasmic reticulum

Redox

Glutathione

Transport

Chemical screeing

Résumé

Le réticulum endoplasmique est le lieu de synthèse et de maturation des protéines destinées à être secrétées ou adressées à la membrane plasmique. Il est aussi le lieu de stockage du calcium cellulaire et coordonne la synthèse et le trafic lipidique. De part ces fonctions, il joue un rôle central dans de nombreux processus de signalisation. La maturation des protéines dans le RE implique très fréquemment la formation de ponts disulfures. De fait le RE est doté d'une machinerie enzymatique permettant d'oxyder les protéines en cours de repliement, ce qui le distingue de la plupart des autres compartiments cellulaires. La présence dans le RE de glutathion, en concentrations millimolaires, pose question quant au rôle joué par ce tripeptide réducteur dans un compartiment oxydant. L'objectif de ma thèse a été d'appréhender quel(s) rôle(s) pouvait avoir le glutathion dans le RE mammifère, en m'attachant plus particulièrement à comprendre les mécanismes responsables de et/ou stimulant son entrée dans le RE. Pour cela, nous avons mis au point un système de sondes nous donnant accès aux niveaux intraluminaux de GSH. Ce système nous a permis de proposer un modèle décrivant l'import du GSH vers le RE qui fonctionnerait selon deux modes ; Le premier implique un transport passif imposé par le gradient de concentration établi entre le cytosol et le RE. La hausse des niveaux cytosoliques de GSH entraine une réduction modérée du RE. Cette réduction reste limitée et n'est pas suffisante pour induire une UPR efficace, suggérant l'existence de mécanismes de contrôle. Les modalités de ce transport ont montré une dépendance au métabolisme de la cystéine, bien qu'une réduction directe de notre système de sondes par la cystéine semble écartée. Le second mode de transport du GSH est induit par une déplétion des stocks calciques du RE, et survient sans modification des niveaux de GSH intracellulaires, ce qui suggère un transport actif. Ce mode de transport semble indépendant du métabolisme de la cystéine. Dans un second temps, nous avons mis à profit ces connaissances pour mettre en place un crible chimique haut débit en vue d'identifier des molécules capables de moduler l'import provoqué par le second mode de transport décrit ci-dessus. Plusieurs types de molécules ont été identifiées, parmi lesquelles de possibles inhibiteurs ou stimulateurs du transport du GSH vers le RE. Des expériences de caractérisations des concentrations luminales de GSH mais aussi de calcium ont permis d'initier l'étude mécanistique de l'action des composés identifiés lors du crible. Nos résultats ont permis de développer des systèmes de détection et de caractérisation des flux du glutathion au sein du réticulum endoplasmique. S'il semble clair que son transport s'effectue selon différentes modalités, certaines semblent nécessiter des caractérisations plus approfondies. Notamment, la maitrise du métabolisme de la cystéine et l'équilibre du pH au sein du RE semblent être deux voies qui permettront de compléter nos modèles de transport. Le crible chimique mis en place a révélé un grand nombre de molécules jouant sur le potentiel du GSH au sein du RE. Identifier une molécule dont le mécanisme module le transport du GSH permettra à terme de gérer plus finement le transport du GSH, et ainsi d'apprécier sa fonction localement.

The endoplasmic reticulum is the site of synthesis and maturation of proteins destined to be secreted or sent to the plasma membrane. It is also the storage site for cellular calcium and coordinates lipid synthesis and trafficking. As a result of these functions, it plays a central role in many signaling processes. Protein maturation in the ER frequently involves the formation of disulfide bridges. In fact, the ER has an enzymatic machinery dedicated to the oxidation of proteins during folding, which distinguishes it from most other cellular compartments. The presence of millimolar concentrations of glutathione in the ER raises questions about the role played by this reducing tripeptide in such an oxidizing compartment. The aim of my thesis was to understand the role(s) of glutathione in the mammalian ER, with a particular emphasis on the mechanisms responsible for and/or stimulating its entry into the ER. To achieve this, we developed a probe system giving us access to intraluminal GSH levels. This system has allowed us to propose a model describing the import of GSH into the ER, which would operate in two modes The first involves passive transport imposed by the concentration gradient established between the cytosol and the ER. The increase in cytosolic GSH levels leads to a moderate reduction in the ER. This reduction remains limited and is not sufficient to induce effective UPR, suggesting the existence of control mechanisms. The modalities of this transport showed a dependence on cysteine metabolism, although a direct reduction of our probe system by cysteine seems to be ruled out. The second mode of GSH transport is induced by depletion of ER calcium stores, and occurs without any change in intracellular GSH levels, suggesting active transport. This mode of transport appears to be independent of cysteine metabolism. We then used this knowledge to set up a high-throughput chemical screening in order to identify molecules capable of modulating the import caused by the second mode of transport described above. Several types of molecules were identified, including possible inhibitors or stimulators of GSH transport to the ER. Experiments to characterize luminal concentrations of GSH and calcium were used to initiate a mechanistic study of the action of the compounds identified during the screen. Our research has led us to develop systems for detecting and characterizing glutathione flows within the endoplasmic reticulum. While it seems clear that glutathione is transported in a variety of ways, some would appear to require more detailed characterization. In particular, control of cysteine metabolism and pH balance within the ER appear to be two avenues that will enable our transport models to be completed. The chemical screen set up revealed a large number of molecules that influence the potential of GSH within the ER. Identifying a molecule whose mechanism modulates GSH transport will eventually enable us to manage GSH transport more finely, and thus assess its function locally.