Interaction du microenvironnement tumoral acide et de la signalisation calcique dans la progression de l'adénocarcinome du canal pancréatique (PDAC)

Acidic tumor microenvironment and Ca2+ signaling interplay in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC) progression

• Auteur / Autrice : Madelaine Audero
• Direction : Natalia Prevarskaya, Alessandra Fiorio Pla
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie, Biologie des organismes, populations, interactions
• Date : Soutenance le 13/04/2023
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....) en cotutelle avec Università di Torino (Turin, Italie)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : PHYCELL - Laboratoire de physiologie cellulaire
• Jury : Président / Présidente : Albrecht Schwab
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Ildikó Szabó
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Luis Pardo, Sébastien Roger

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cancer -- Caractère envahissant

Acidose

Canaux calciques

Micro-environnement tumoral

Adénocarcinome canalaire pancréatique

Mots clés libres

Canaux SOC

Acidic tumor microenvironment

Ca2+ signaling

Pdac

Store-Operated Calcium Entry

Ca2+ oscillations

Acid-Selection

Résumé

L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est une maladie mortelle caractérisée par un micro-environnement tumoral (TME) extrêmement acide (˂pHe 6,5) qui joue un rôle important dans son début et sa progression. Dans ce contexte, les canaux ioniques perméables au Ca2+ représentent de bons candidats cibles en raison de leur capacité à intégrer des signaux provenant de la TME. Les canaux Ca2+ sont en effet des capteurs de pH capables d'intégrer les signaux de la TME pour activer les voies intracellulaires en aval liées à la progression du PDAC. Bien que les rôles de l'acidose tumorale et de la signalisation du Ca2+ dans la progression du cancer soient bien établis, l'hypothèse d'une TME acide utilisant la signalisation du Ca2+ comme voie préférentielle pour soutenir la progression tumorale n'a pas encore été suffisamment explorée.Mon travail de doctorat visait à étudier les changements phénotypiques et génétiques des cellules PDAC lors d'un stress acide au cours des différentes étapes de sélection et à évaluer comment l'acidose tumorale module les signaux Ca2+ et les phénotypes dans les lignées cellulaires PDAC, avec un accent particulier sur les oscillations Ca2+ et Store-Operated Ca2+ entry (SOCE). À cette fin, les cellules PANC-1 et Mia PaCa-2 ont été soumises à une pression acide à court et à long terme et à une récupération à pHe 7,4. Ce dernier traitement visait à imiter les bords du PDAC et l'évasion consécutif des cellules cancéreuses de la tumeur. L'impact de l'acidose a été évalué sur la morphologie cellulaire, la prolifération, l'adhésion, la migration, l'invasion, l'activité des invadopodes et la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) par des tests fonctionnels in vitro et le séquençage de l'ARN, ainsi que sur les signaux Ca2+ intracellulaires avec Fura-2. Nos résultats indiquent qu'un court traitement acide limite la croissance, l'adhésion, l'invasion et la viabilité des cellules PDAC. Au fur et à mesure que le traitement acide progresse, il sélectionne les cellules cancéreuses ayant des capacités de migration et d'invasion accrues induites par l'EMT, ce qui augmente encore leur potentiel métastatique lorsqu'elles sont réexposées à un pHe 7,4. L'analyse RNA-seq des cellules PANC-1 exposées à une acidose de courte durée et récupérées à pHe 7,4 a révélé un recâblage transcriptomique distinct. Il est intéressant de noter que les cellules PANC-1 sont caractérisées par des oscillations Ca2+ plus lentes pendant une exposition à l'acide à court terme par rapport aux cellules de contrôle et par une tendance à la régulation négative d'ORAI1 au niveau de l'ARNm, tandis que l'acidose à long terme et le rétablissement à un pH neutre déterminent le rétablissement d'oscillations Ca2+ rapides et la régulation positive d'ORAI1. Dans tous nos modèles cellulaires, les oscillations du Ca2+ sont dépendantes de SOCE, car le blocage d'ORAI1 par Synta66 et siORAI1 entraîne une altération de l'initiation et du maintien des oscillations du Ca2+. Ces données sont en corrélation avec le SOCE dans les cellules PANC-1, qui est diminuée pendant le traitement acide à court terme, et augmentée dans les cellules sélectionnées pour l'acide avec et sans récupération à pHe 7,4. Enfin, l'entrée de Ca2+ médiée par ORAI1 pourrait être impliquée dans l'activation des cascades de signalisation qui conduisent à l'augmentation de la migration et de l'invasion de tous les modèles cellulaires exposés à un pHe acide, car le traitement par Synta66 et siORAI1 n'ont pas affecté l'invasion et la migration des cellules de contrôle.En conclusion, nos résultats montrent que la sélection induite par l'acide contribue à l'acquisition d'un phénotype plus agressif dans les cellules de PDAC, caractérisé par une augmentation du SOCE, nécessaire à la génération d'oscillations rapides de Ca2+ qui peuvent activer des voies de signalisation Ca2+-dépendantes impliquées dans la progression du PDAC.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the most common cancer affecting the pancreas, characterized by an unsatisfactory 5-year survival rate of around 10%, and to date, there are no effective therapeutic options for PDAC. This is in part due to a highly desmoplastic and immunosuppressive microenvironment that contributes to therapeutic failure. Moreover, the PDAC tumor microenvironment is featured by high acidosis (˂ pHe 6.5), a result of the metabolic reprogramming ("Warburg effect"), and hypoxic conditions, which offers important cues for its aggressiveness by selecting cancer cell phenotypes with competitive benefits for PDAC progression. In this context, Ca2+-permeable ion channels are known to regulate several hallmarks of cancer, including in PDAC. Therefore, they represent good target candidates due to their ability to integrate signals from the TME. Ca2+ channels are indeed pH and hypoxia sensors able to transduce TME signals to activate intracellular downstream pathways linked to PDAC progression. Although the roles of tumor acidosis and Ca2+ signaling in cancer progression are well established, the hypothesis of acidic TME employing Ca2+ signaling as a preferential route for sustaining tumor progression has not yet been sufficiently explored.My Ph.D. work aimed to study the phenotypic and genetic changes of PDAC cells upon acidic stress along the different stages of selection and to evaluate how tumor acidosis modulates Ca2+ signals and phenotypes in the PDAC cell lines, with a particular focus on Ca2+ oscillations and Store-Operated Ca2+ entry (SOCE). To this end, PANC-1 and Mia PaCa-2 cells were subjected to short- and long-term acidic pressure and recovery to pHe 7.4. The latter treatment was to mimic PDAC edges and consequent cancer cell escape from the tumor. The impact of acidosis was assessed for cell morphology, proliferation, adhesion, migration, invasion, invadopodia activity, and epithelial-mesenchymal transition (EMT) via functional in vitro assays and RNA sequencing, and for intracellular Ca2+ signals using Fura-2. Our results indicate that short acidic treatment limits the growth, adhesion, invasion, and viability of PDAC cells. As the acid treatment progresses, it selects cancer cells with enhanced migration and invasion abilities induced by EMT, thereby further enhancing their metastatic potential when re-exposed to pHe 7.4. RNA-seq analysis of PANC-1 cells exposed to short-term acidosis and pHe-selected recovered to pHe 7.4 revealed distinct transcriptome rewiring. We noted an enrichment of genes relevant to proliferation, migration, EMT, and invasion in acid-selected cells. Interestingly, PANC-1 cells are characterized by slower Ca2+ oscillations during short-term acid exposure compared to control cells and a tendency of ORAI1 downregulation at mRNA levels, while long-term acidosis and recovery to neutral pHe determine the recovery of fast Ca2+ oscillations and upregulation of ORAI1. In all our cell models, Ca2+ oscillations are SOCE-dependent, as ORAI1 blockade with Synta66 and siORAI1 results in impaired Ca2+ oscillations' initiation and maintenance. These data correlate with SOCE in PANC-1 cells, which is decreased during the short-term acid treatment, and increased in acid-selected cells with and without recovery to pHe 7.4. Finally, ORAI1-mediated Ca2+ entry might be involved in the activation of signaling cascades that lead to the increased migration and invasion of all the cell models exposed to acidic pHe, as Synta66 treatment and siORAI1 didn't affect control cells' invasion and migration.In conclusion, our findings show that acid-induced selection contributes to the acquisition of a more aggressive phenotype in PDAC cells, characterized by upregulation of SOCE, required for the generation of fast Ca2+ oscillations which may trigger Ca2+-dependent signaling pathways involved in PDAC progression.