Identification des répertoires d'affinité des cellules sécrétrices d'anticorps

Identification of antibody secreting cell affinity repertoires

• Auteur / Autrice : Broketa Matteo
• Direction : Pierre Bruhns
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 21/12/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale physiologie, physiopathologie et thérapeutique
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Anticorps en Thérapie et Pathologie
• Jury : Président / Présidente : Natalia Freund
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jordan Dimitrov, Béhazine Combadière
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christoph Merten, Marion Espéli

Mots clés

Mots clés contrôlés

SARS-CoV-2 (virus)

Plasmocytes

Anticorps

Lymphocytes B

Mots clés libres

Anticorps

Plasmocytes

B cell

Antibodies

Plasma cells

B cell

Résumé

Cette recherche à explorer les complexités des affinités d’anticorps des cellules sécrétant des anticorps (CSA). Le premier objectif était de caractériser la réponse de l’CSA à la vaccination par ARNm contre le SRAS-CoV-2. Les nouveaux vaccins à ARNm pour lutter contre la pandémie de COVID-19 a présenté une opportunité unique d’étudier une nouvelle réponse humorale des cellules B après l’immunisation. Nous avons utilisé un test microfluidique, DropMap, capable de mesurer la sécrétion d'anticorps et l'affinité envers l'antigène pour caractériser les caractéristiques des CSA dans les semaines et les mois suivant l'administration du vaccin à ARNm, avec une distinction faite entre les individus en fonction des antécédents du SRAS-CoV-2 infection. Notre caractérisation de la réponse des CSA à la vaccination par ARNm contre le SRAS-CoV-2 a fourni des informations précieuses sur la façon dont les cellules B répondent aux nouveaux vaccins et aux répertoires d'affinité lors de la vaccination humaine. Le deuxième objectif était de mesurer les répertoires d’affinité d’une population de cellules B non sécrétant de manière native, les cellules B mémoire (Bmem), après vaccination par ARNm contre le SRAS-CoV-2. Ceci impliquait de caractériser les répertoires d'affinité des anticorps dérivés de Bmem envers de nombreuses variantes du domaine de liaison au récepteur (RBD) du SRAS-CoV-2 en mettant en œuvre un système de criblage à haut débit basé sur des mesures d'interférométrie de biocouche. Le troisième objectif était de développer une nouvelle technique (appelée DropPick) pour récupérer des cellules d'intérêt à partir de DropMap. DropMap est une technique puissante pour l’identification directe des CSA et la caractérisation par affinité. Cependant, il reste beaucoup plus à discerner en analysant ces cellules d’intérêt à l’aide de méthodes supplémentaires, telles que la cytométrie en flux pour le phénotypage ou le séquençage des récepteurs des cellules B pour les analyses clonales et la réexpression. Mes travaux de thèse ont montré qu'après avoir reçu le vaccin BNT162b2, des CSA de haute affinité ont été initialement induits ciblant à la fois les variantes Hu-1 et Omicron RBD, mais ont présenté un déclin rapide. Les CSA de faible affinité représentaient systématiquement plus de 65% de la réponse spécifique des CSA à tous les moments observés. Nos mesures d’affinité sur les anticorps Bmem provenant d’individus vaccinés ont révélé des clones à haute affinité contre plusieurs variantes de RBD présentant de maturation d’affinité ; la comparaison des résultats entre les variantes a permis de déterminer les épitopes clés de liaison aux anticorps. Suite à cette cohorte d’anticorps Bmem, nous avons également découvert que l’évolution virale vers la variante Omicron RBD entraînait une évasion des Bmems mutés vers Hu-1 RBD avec une affinité élevée, avec une impacte élevée sur des anticorps neutralisants puissants Hu-1 et Beta. J'ai développé un système pour marquer les cellules d'intérêt avec des marqueurs photoactivables au sein de DropMap et de la plateforme pour réaliser une photoactivation cellulaire par illumination UV ciblée. Cela impliquait la création de programmes automatisés pour les analyses en temps réel du test DropMap ainsi que le contrôle macro des utilitaires du microscope pour fournir un éclairage discret aux gouttelettes. J'ai également montré la capacité de cette technique à produire une population par cytométrie avec une efficacité jusqu'à 70% avec un potentiel de tri et de futures analyses en aval. Ces résultats contribueront aux efforts en cours pour comprendre le rôle de l’affinité dans les réponses CSA. Nos larges répertoires d’affinité fournissent des informations fonctionnelles précieuses sur les réponses des cellules B à la vaccination contre le SRAS-CoV-2. La plateforme DropPick a montré le potentiel d’exploiter ces études pour collecter des données moléculaires provenant de sous-ensembles fonctionnels spécifiques.

This research aimed to explore the complexities of antibody affinities of antibody-secreting cells (ASCs) in the context of both vaccination and autoimmune responses. The first aim was to characterize the ASC response to mRNA vaccination against SARS-CoV-2. The advent of novel mRNA vaccines to tackle the COVID-19 pandemic presented a unique opportunity to study a novel humoral B cell response post-immunization. We used a droplet microfluidic assay, DropMap, able to measure single cell antibody secretion and affinity towards antigen to characterize at high throughput the functional characteristics of ASCs in the weeks and months following mRNA vaccine administration, with a distinction made between individuals based on prior SARS-CoV-2 infection. Our characterization of the ASC response to mRNA vaccination against SARS-CoV-2 has provided valuable insights into how B cells respond to novel vaccines and affinity repertoires during human vaccination. The second aim was to measure the affinity repertoires of a non-natively secreting B cell population, memory B cells (Bmem), following mRNA vaccination against SARS-CoV-2. This involved characterizing the affinity repertoires of Bmem-derived antibodies towards numerous SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD) variants by implementing a high throughput screening system based on biolayer interferometry (BLI) measurements. The third aim was to develop a novel technique (termed DropPick) for recovering cells of interest from DropMap. DropMap is a potent technique for direct identification of ASCs and affinity characterization. However, there is much more to be discerned from analyzing these cells of interest using additional methods, such as flow cytometry for phenotyping or B cell receptor sequencing for clonal analyses and re-expression. My thesis work has shown that after receiving the BNT162b2 vaccine targeting the Hu-1 SARS-CoV-2 Spike protein, high-affinity plasmablasts were initially induced targeting both the Hu-1 and Omicron Spike RBD variants but exhibited a rapid decline. Surprisingly, plasmablasts with low affinity consistently constituted more than 65% of the specific plasmablast response at all observed time points. Our high throughput BLI affinity measurements on Bmem antibodies from similarly vaccinated individuals found high affinity clones against several RBD variants with signs of affinity maturation; comparing results between variants allowed for key antibody binding epitopes to be determined. Following this cohort of Bmem antibodies also found that viral evolution to the Omicron RBD variant resulted in a large evasion of Bmems mutated towards Hu-1 RBD with high affinity, with especially high evasion of potently Hu-1 and Beta neutralizing antibodies. In parallel, I have developed a system to label cells of interest using photoactivatable markers within DropMap and the technical platform to achieve targeted cell photoactivation by targeted UV illumination. This involved the creation of automated programs for DropMap assay real-time analyses as well as macro control of microscope utilities to deliver discrete illumination to droplets. I have also shown the ability for this workflow to yield a clear population by flow cytometry with up to 70% efficiency, with the potential for sorting and future downstream analyses. These results will aid ongoing efforts to understand the role of affinity in ASC responses and their immune contexts. Our data provide broad affinity repertoires that provide valuable functional insights into B cell responses to SARS-CoV-2 and mRNA vaccination. The development of the DropPick platform has shown the potential to further leverage these studies to collect molecular data from specific functional subsets.