Restauration d’une spermatogenèse fonctionnelle chez des souris infertiles par thérapie in vivo

Restoration of a functional spermatogenesis in infertile mice by in vivo therapy

• Auteur / Autrice : Charline Vilpreux
• Direction : Christophe Arnoult
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie du développement oncogenèse
• Date : Soutenance le 16/10/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut pour l'avancée des biosciences (Grenoble, Isère, France ; 2016-....)
• Jury : Président / Présidente : François Vialard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christophe Arnoult, Virginie Faure, Pascale Lybaert, Bernard Verrier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : François Vialard, Chantal Pichon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Stérilité masculine

Spermatozoïdes

Fécondation in vitro

Électroporation

Mots clés libres

Électroporation in vivo

Fécondation

Spermatozoïdes

Infertilité masculine

Human Infertility

Sperm Cell

Fertilization

In vivo mRNA Electroporation

Résumé

Avec 7% des hommes considérés comme stériles dans le monde, l’infertilité estdevenue un problème de santé publique. Parmi les hommes infertiles, 9% d’entre euxsouffrent d’une absence totale de spermatozoïde dans leur éjaculat. La spermatogenèse est un processus physiologique complexe impliquant l’expression de milliers de gènes. De ce fait, l’absence de spermatozoïde peut être due à un défaut monogénique entrainant la disparition de la protéine correspondante ou la production d’une protéine défaillante. Malgré les techniques d’assistance médicale à la procréation, ces patients sont dans une impasse thérapeutique. En effet, ces approches nécessitent la présence de spermatozoïdes. L’objectif de cette thèse est de développer une nouvelle solution thérapeutique pour traiter l’infertilité masculine due à un défaut monogénique. L’approche proposée consiste à effectuer un sauvetage temporaire de la production de la protéine manquante. Le principe repose sur la délivrance, dans les cellules germinales, de l’ARNm de la protéine manquante ou d’un plasmide non intégratif nommé « Enhanced Episomes Vector » (EEV) contenant la séquence d’ADN codante pour la protéine d’intérêt.La première partie de la thèse a consisté à comparer la durée de l’expression deprotéines rapportrices via l’injection et l’électroporation in vivo d’ARNm ou de plasmide EEV. Pour la première fois, des expériences d’imagerie in vivo ont montré que l’expressionprotéique induite par l’ARNm débute dès 1 jour et perdure jusqu’à 21 jours post-chirurgie. Il a également été observé, grâce à l’analyse microscopique de testicules entiers transparisés, que les cellules exprimant les protéines rapportrices étaient des cellules germinales dont des spermatozoïdes. Concernant l’injection d’EEV, l’expression protéique a été visible dès 1 jour et jusqu’à 112 jours post-chirurgie. Néanmoins, les cellules testiculaires exprimant les protéines rapportrices après 7 jours étaient uniquement des cellules de Sertoli.La seconde partie de la thèse a consisté à restaurer une spermatogenèse fonctionnelledans un modèle murin infertile via l’injection et l’électroporation d’ARNm ou de plasmide non intégratif EEV. Les souris utilisées présentent une asthéno-tératozoospermie induite par l’absence de la protéine ARMC2. L’injection et l’électroporation in vivo d’EEV-Armc2, n’a pas permis de restaurer la mobilité des spermatozoïdes contrairement à l’injection d’ARNm-Armc2. En effet, des spermatozoïdes épididymaires mobiles ont été observés 3 et 5 semaines post-chirurgie chez les souris Armc2 KO injectées avec l’ARNm.Pour la première fois, les résultats présentés dans cette thèse mettent en évidence quel’approche alliant l’injection d’ARNm et l’électroporation in vivo est une solution prometteuse pour lutter contre l’infertilité masculine.Mots clés : spermatozoïdes, infertilité, thérapie protéique, ARNm, EEV, micro-injection in vivo et électroporation, asthéno-térozoospermie, ARMC2

With 7% of men considered infertile worldwide, infertility has become a public healthissue. Among infertile men, 9% of them suffer from a total absence of sperm in their ejaculate. Spermatogenesis is a complex physiological process involving the expression of thousands of genes. Therefore, the absence of sperm may be due to a monogenic defect leading to the disappearance of the corresponding protein or the production of a defective protein. Despite medically assisted reproduction techniques, these patients are in a therapeutic impasse. Indeed, these approaches require the presence of sperm.The objective of this thesis is to develop a new therapeutic solution to treat maleinfertility due to a monogenic defect. The proposed approach consists of carrying out atemporary rescue of the production of the missing protein. The principle is based on thedelivery, in the germ cells, of the mRNA of the missing protein or of a non-integrative plasmid called “Enhanced Episomes Vector” (EEV) containing the DNA sequence coding for the protein of interest.The first part of the thesis consisted of comparing the persistence of the expression ofreporter proteins via injection and in vivo electroporation of mRNA or EEV plasmid. For thefirst time, in vivo imaging experiments showed that mRNA-induced protein expression starts as early as 1 day and lasts up to 21 days post-injection. It was also observed through microscopic analysis of transparized whole testicles that the cells expressing the reporter proteins were the germ cells including sperm cells. Concerning the injection of EEV, the protein expression was visible from 1 day and up to 112 days post-surgery. Nevertheless, the testicular cells expressing the reporter proteins after 7 days were only Sertoli cells.The second part of the thesis consisted of restoring functional spermatogenesis in an infertile mouse model via the injection and electroporation of mRNA or non-integrative EEV plasmid. The mice used show astheno-teratozoospermia induced by the absence of the ARMC2 protein. In vivo injection and electroporation mArmc2 restored partially sperm motility, . Indeed, motile epididymal sperm cells were observed 3 and 5 weeks post-surgery in Armc2 KO mice injected with mRNA.In the other hand, the injection of EEV-Armc2 was unsuccessful.The results presented in this thesis show that the approach combining injection and invivo electroporation of mRNA is a promising solution to fight against male infertility.Key words: sperm, infertility, protein therapy, mRNA, EEV, In Vivo Microinjection andElectroporation, astheno-teratozoospermia, ARMC2