Apports de l'étude de mutants de tomate à la compréhension de la régulation du développement du fruit et du rendement

Tomato mutant study provides new insights to the understanding of fruit development and yield regulation

• Auteur / Autrice : Gabriel Hoang
• Direction : Martine Lemaire-chamley
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences agronomiques
• Date : Soutenance le 28/04/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie du fruit et pathologie
• Jury : Président / Présidente : Jérôme Joubès
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jérôme Joubès, Julien Pirrello, Jose Jimenez-Gomez, Hilde Nelissen, Valérie Schurdi-Levraud
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Julien Pirrello, Jose Jimenez-Gomez
• DOI : 10.70675/0e793d75z1849z4e3fzac00z1e52ee2322d3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Tomate

Cultures

Cultures -- Rendements

Méthanesulfonate d'éthyle

Mutation chez les plantes

Cytologie -- Technique

Histologie -- Technique

Mots clés libres

Rendement

Tomate

Fruit

Mutant EMS

Tissu loculaire

Mapping by sequencing

Yield

Tomato

Fruit

EMS mutant

Locular tissue

Mapping by sequencing

Résumé

Le rendement en fruits est un trait majeur et représente un enjeu agronomique important notamment pour la tomate, Solanum lycopersicum. Il s'agit d'un trait multigénique pour lequel le déterminisme physiologique n'est pas entièrement compris. Le rendement en fruits est principalement déterminé par la valeur adaptative de la plante, définie à la fois par les performances des organes végétatifs et reproducteurs. De nombreux gènes ou QTL impliqués dans la régulation de la morphologie des tissus du fruit et/ou de la division/expansion cellulaire ont un effet sur la croissance des fruits, avec des conséquences sur le rendement. Dans ce contexte, mon travail de thèse visait à identifier, valider et caractériser les mutations causales responsables d’altérations du développement des fruits et du rendement en suivant des approches de génétique directe et inverse.J’ai d’abord cherché à identifier les mutations causales responsables d’un phénotype d'augmentation du rendement chez deux mutants EMS d'une collection Micro-Tom. Les analyses phénotypiques ont mis en évidence une augmentation du rendement total de +13 et +27% chez les mutants P17F7 et P22H3 principalement due à des changements de taille du fruit. Le phénotypage des composantes du rendement dans les populations en ségrégation BC1F2 associé à une stratégie de cartographie par séquençage, du génotypage KASPAR et à une « Bulk Segregant Analysis », m'a permis d'identifier deux loci sur les chromosomes 04 et 08 liés à l’augmentation de rendement. Un locus délétère fort a été identifié sur le chromosome 09 chez P17F7. Une cartographie basée sur le génotypage KASPAR des mutations EMS m'a permis de localiser les QTL de rendement sur la carte génétique. Les résultats ont mis en évidence un homologue d’AtSWELLMAP1, comme gène candidat pour le locus délétère du chromosome 09 dont la production de lignées transgéniques a été entreprise. Pour les chromosomes 04 et 08 plusieurs gènes candidats ont été identifiés. Des analyses de rendement couplées à une sélection assistée par marqueurs d’individus BC1F3/F4 recombinants ou la validation par lignées transgéniques sont désormais nécessaires afin d'identifier les mutations causales.Par ailleurs, j'ai réalisé la caractérisation fonctionnelle du facteur de transcription SlZFP2, de type zinc finger-C2H2, impliqué dans le développement du fruit et la différenciation du tissu loculaire. Il a été précédemment montré que l'inactivation du facteur de transcription SlZFP2 par insertion d’un rétro-transposon était responsable de l’inhibition de la croissance du tissu loculaire, le tissu gélifié qui entoure les graines. Ce tissu se différencie à partir des cellules de l'axe central ou placenta après la fécondation des fruits et est considéré comme important pour le développement des graines et la maturation du fruit. Au cours de ce travail, j'ai montré que les lignées SlZFP2 CRISPR/Cas9 KO présentent un défaut majeur de développement du tissu loculaire et de la forme des graines ainsi qu'une réduction de la taille et du poids final des fruits. Les analyses histologiques et cytologiques réalisées de 0 à 25 jours après anthèse (JAA) ont révélé que l’inhibition de la croissance du tissu loculaire était due à une réduction drastique de la taille des cellules et des niveaux de ploïdie par rapport aux lignées WT dès 4 JAA. Les analyses RT-qPCR ont montré que les régulateurs moléculaires des mécanismes de division cellulaire et d'endoréduplication présentaient des changements significatifs des profils d'expression suggérant que SlZFP2 pourrait être impliqué dans la synchronisation et/ou la régulation de ces deux processus. La microdissection par capture laser couplée au RNA-seq du tissu loculaire du fruit 4 JAA dans le WT et une lignée CRISPR/Cas9 a permis de mettre en évidence les changements d'expression globaux entre les deux lignées et de proposer une première liste de cibles directes potentielles du facteur de transcription SlZFP2.

Fruit yield is a major trait in fleshy fruit species and represents an important agronomic issue especially for tomato, Solanum lycopersicum. However, it is a complex multigenic trait for which physiological determinism is not fully understood. Indeed, fruit yield is mainly driven by the general plant fitness, defined by both vegetative and reproductive organs performances. Many genes or QTLs involved in the regulation of fruit tissue morphology and/or cell division/expansion have been shown to have an effect on fruit growth, with consequences on fruit yield. In this context, my PhD work aimed to identify, validate and characterize causal mutations responsible for alterations in both fruit development and yield following forward and reverse genetic approaches.First, I developed a forward genetic approach to identify causal mutations responsible for a yield-increase phenotype in two EMS mutants from a Micro-Tom collection. Phenotypic analyses pointed out a total yield increase of +13 and +27% in P17F7 and P22H3 mutants mainly driven by fruit size changes. Phenotyping of yield trait components in BC1F2 segregant populations associated to a mapping-by-sequencing strategy, combined with KASPAR genotyping and bulk segregant analysis, allowed me to identify two positives loci on chromosomes 04 and 08 linked with the yield increase phenotype in both mutants. In addition, a strong deleterious locus was also identified on chromosome 09 within the BC1F2 P17F7 population. A quantitative trait locus (QTL) mapping using the KASPAR genotyping of EMS mutations as markers allowed me to locate the yield trait components QTLs on the genetic maps and the corresponding chromosomal regions on physical maps were screened for causal candidate EMS mutations. The results pointed out a homologue of AtSWELLMAP 1, a leaf and fruit cell size regulator, as likely candidate gene for chromosome 09 deleterious locus. The production of transgenic lines (CrispR/cas9 KO and over-expression) of SlSMP1 for further functional characterization studies were undertaken. Mapping results of chromosomes 04 and 08 led to larger candidate loci, which comprise several candidate genes. Yield analyses coupled with KASPAR marker-assisted selection of recombinant BC1F3/F4 individuals for candidate loci or generation of transgenic lines for the different candidate genes located in large QTLs are now necessary to identify causal mutations of yield increase.Then, I performed functional characterization of the C2H2 zinc finger transcription factor SlZFP2 involved in fruit development and locular tissue differentiation. Indeed, in the laboratory, the knocked out of SlZFP2 transcription factor by retrotransposon insertion was formerly shown to be responsible for the growth inhibition of locular tissue, the jelly-like tissue surrounding the seeds. This tissue differentiates from fruit central axis or placental cells after fertilization and is believed to be important for seed development and fruit ripening. During my PhD, I showed that SlZFP2 CRISPR/Cas9 KO lines exhibit major developmental defect of locular tissue and seed shape as well as a reduction in the final fruit size and weight. Histological and cytological analyses from 0 to 25 days post anthesis (DPA) revealed that locular tissue growth disruption was due to both a drastic reduction in cell size and ploidy levels compared to WT lines as soon as 4 DPA. RT-qPCR analyses showed that molecular regulators of both cell division and endoreduplication mechanisms displayed significant changes in expression profiles suggesting that SlZFP2 might be involved in the timing and/or regulation of both processes. Laser capture microdissection coupled with RNA-Seq of 4 DPA fruit locular tissue in the WT and a CRISPR/Cas9 line allowed to highlight global expression changes between both lines and to propose a first list of SlZFP2 transcription factor potential direct targets.