Etudes biochimiques et structurales de glucose déshydrogénases soluble et membranaire

Biochemical and structural studies of soluble and membrane-bound glucose dehydrogenases

• Auteur / Autrice : Victoria Lublin
• Direction : Claire Stines-Chaumeil, Marie-France Giraud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 26/04/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche Paul Pascal (Pessac ; 1963-....)
• Jury : Président / Présidente : Daniel Picot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie-France Giraud, Daniel Picot, Solange Morera, Fabrice Neiers, Alexander Kuhn
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Solange Morera, Fabrice Neiers
• DOI : 10.70675/bc96c1e6z5dc6z4fa7z9be8zc5bde06b4f1d

Mots clés

Mots clés contrôlés

Enzymologie

Cristallisation

Rayons X -- Diffraction

Biocapteurs

PQQ (coenzyme)

Glutamate déshydrogénase

Mots clés libres

Glucose déshydrogénases soluble ou membranaire

Production recombinante (en bactérie et in vitro)

Purification d’enzyme

Enzymologie

Cristallisation/structure RX

Glucose dehydrogenases

Recombinant production (bacteria and cell-Free)

Enzyme purification

Enzymology

X-Ray diffraction

Résumé

A ce jour, deux types de glucose déshydrogénases (GDH) à pyrrolo-quinoléine quinone (PQQ), ont été identifiés: une enzyme de type membranaire (mGDH) et une enzyme de type soluble (sGDH). Bien que les deux GDHs soient phylogénétiquement et structurellement distinctes, elles catalysent la même réaction d’oxydation du glucose en gluconolactone chez les bactéries à Gram négatives. Cette activité d’oxydation les rend particulièrement adaptées pour des utilisations dans des biocapteurs à glucose. Depuis la fin des années 70, la sGDH a largement été étudiée et utilisée comme enzyme anodique du fait de son activité catalytique élevée et de son insensibilité au dioxygène. L’enzyme présente cependant deux inconvénients : (i) une large spécificité de substrat, conduisant à des mesures imprécises de la glycémie, (ii) une faible stabilité dans le temps, inférieure aux autres enzymes à glucose. Comparée à la sGDH, peu d’informations sont disponibles sur la mGDH, principalement en raison des difficultés rencontrées lors de la production de la protéine. Toutefois, comme elle est naturellement immobilisée dans les membranes, cette enzyme offre un grand potentiel pour optimiser le transfert des électrons à la surface des électrodes. L'objectif de ce travail de thèse était de caractériser biochimiquement et structurellement les PQQ-GDHs pour de potentielles applications dans des biocapteurs à glucose. Les limites de production de la mGDH d'Escherichia coli et d'Acinetobacter calcoaceticus ont été éliminées à l'aide d'un système d'expression in vitro. La mise au point d’un protocole d’activation de la mGDH est encore en cours d’étude. Les études structurales par dichroïsme circulaire et microscopie électronique en coloration négative laissent penser que les enzymes sont correctement repliées. Pour la sGDH d’A. calcoaceticus, des études de relation structure/fonction ont été réalisées sur l’holo-enzyme sauvage et sur deux mutants (Y343F et D143E/Y343F), sélectionnés pour leur plus grande spécificité pour le glucose. La détermination de la structure des trois enzymes par diffraction des rayons-X a permis d'identifier un cofacteur clivé. Un clivage similaire du PQQ isolé a été décrit dans des conditions acides et lors d'un traitement par H2O2. La preuve est ici apportée que les enzymes sGDH sous forme apo ou holo catalysent la production d’H2O2 de façon directe ou indirecte. Des expériences spectroscopiques ont permis de suivre la dégradation du PQQ et la perte de l’activité d'oxydation du glucose après incubation à 25 °C. Ces résultats suggèrent que la sGDH est sensible à son auto-production d’H2O2. L’ajout de catalase permet de consommer une partie de l’H2O2 produit in situ, ce qui a pour conséquence d’améliorer la stabilité de l’enzyme dans le temps et à 25 °C.Cette thèse s’articule en deux parties. La première partie est consacrée aux travaux portant sur les mGDH, en soulignant les aspects clés tels que leur expression acellulaire, la caractérisation biochimique et biophysique ainsi que les premières études structurales réalisées. Dans la seconde partie, les structures très hautes résolution de l’holo-sGDH sauvage et des deux mutants Y343F et D143E/Y343F (1.19 Å, 1.56 Å et 1.48 Å respectivement) sont présentées et une explication à l'origine de leur instabilité dans le temps est proposée. Ces travaux présentent un intérêt pour la communauté en Enzymologie et en Electrochimie puisqu’ils ouvrent de nouvelles perspectives pour comprendre le mécanisme d’autoproduction d’espèces réactives de l’O2 par l’enzyme ainsi que sur l’optimisation des capteurs à glucose ou plus largement des biopiles à glucose/O2.

Two types of glucose dehydrogenases (GDHs) have been identified to date, both containing pyrrolo-quinoline quinone (PQQ) as a prosthetic group; a soluble enzyme (sGDH) and a membrane-bound enzyme (mGDH), respectively. Although both GDHs are phylogenetically and structurally different, they both catalyze the same kind of reaction in Gram negative bacteria. Indeed, their ability to oxidize glucose in gluconolactone makes them suitable for glucose biosensors. Since the late 70s, sGDH has been widely studied and used as an anodic enzyme taking advantage of its high turnover and molecular oxygen insensitivity. The approach, however, presents two drawbacks : (i) the broad substrate specificity, leading to imprecise blood glucose measurements, (ii) an instability over time, inferior to other glucose oxidizing enzymes. Compared to the soluble form of the enzyme, membrane anchored mGDHs have not been extensively studied so far, mostly because of the difficulties encountered when producing the protein. However, as they are naturally immobilized in membranes, these enzymes show a considerable potential to improve electron transfers in biosensors. The objective of this thesis work was to characterize biochemically and structurally each PQQ-GDHs enzymes for potential applications in glucose biosensors. In the current investigation, the bottleneck caused by the challenging production of mGDH from Escherichia coli and Acinetobacter calcoaceticus has been eliminated using an in vitro expression system. An mGDH activation protocol is still underway. Structural studies by circular dichroism and negative-stain electron microscopy suggest that the enzymes are correctly folded. For the sGDH, from A. calcoaceticus, structure/function relationship studies were done on wild-type and two mutants sGDH (Y343F and D143E/Y343F), selected for their higher substrate specificity to glucose. Crystallographic experiments surprisingly revealed that the prosthetic group PQQ, essential for the enzymatic activity, is in a cleaved form for both wild-type and mutant structures. A similar cleavage of isolated PQQ has been reported, under acidic conditions and under treatment by H2O2. Evidence is provided that the sGDH produces H2O2 at different levels depending on the mutation. In addition, spectroscopic experiments allowed to follow the H2O2 degradation of the prosthetic group and the disappearance of sGDH glucose oxidation activity after incubation at 25 °C. These studies suggest that the enzyme is sensitive to its self-production of H2O2. The catalase addition allows consuming part of the in situ H2O2 produced, and consequently, to improve the enzyme stability over time and at 25°C.In this thesis, work on mGDHs is described, highlighting key aspects such as their cell-free expression, biochemical and biophysical characterization and the first structural studies carried out. The high resolution structures are also presented for the wild-type holo-sGDH (1.19 Å) and both mutants (1.56 Å for Y343F and 1.48 Å for D143E/Y343F) and an explanation to the origin of their instability over time is proposed. This work could be of interest to the Enzymology and Electrochemistry community since it opens new perspectives for understanding the mechanism of self-production of reactive O2 species by the enzyme as well as for the optimization of glucose sensors or more widely glucose/O2 biofuel cells.