Caractérisation structurale des pili de type IV de bactéries à Gram positif

Structural characterization of type IV pili of Gram-positive bacteria

• Auteur / Autrice : Robin Anger
• Direction : Rémi Fronzes
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie - immunologie
• Date : Soutenance le 14/03/2023
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie fondamentale et pathogénicité (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Daniel Lévy
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Daniel Lévy, Olivera Francetic, Nathalie Campo
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Daniel Lévy, Olivera Francetic
• DOI : 10.70675/91f27a58zf009z4f48za8ffz6f0742987923

Mots clés

Mots clés contrôlés

Pneumocoque

Bactéries

Microscopie électronique

Streptocoques

Mots clés libres

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus sanguinis

Pili de type IV

Pilus de transformation

Cryo-Microscopie électronique

Cryo-tomographie électronique

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus sanguinis

Type IV pili

Transformation pilus

Cryo-Electron microscopy

Cryo-Electron tomography

Résumé

Les travaux de cette thèse ont été axés selon trois thématiques. La première partie s'intéresse aux pili impliqués dans la transformation bactérienne. Au cours de ce processus, les bactéries capturent et incorporent de l’ADN exogène provenant de leur environnement et favorisant ainsi leur plasticité génétique et leur adaptabilité. La transformation bactérienne permet à de nombreux agents pathogènes humains d'acquérir une résistance aux antibiotiques et/ou d'échapper aux vaccins via l'incorporation de nouveaux gènes. Il a été précédemment démontré chez Streptococcus pneumoniae, que la première étape de ce processus, la capture de l’ADN à l’extérieur de la bactérie, est réalisée par un filament analogue aux pili de type IV, exposé à la surface de la bactérie : le pilus de transformation.L’objectif de ce projet est de résoudre la structure de ce filament, jusque-là inconnue, chez deux streptocoques modèles : Streptococcus pneumoniae et Streptococcus sanguinis. Le pilus de transformation a été purifié selon différentes méthodes. Nous avons obtenu une structure préliminaire à faible résolution du pilus de compétence de S. pneumoniae en utilisant la cryo-microscopie électronique. Durant cette étude, nous avons également mis en évidence un changement de morphologie du filament après purification, suggérant que son détachement de la surface de la cellule induit une possible dissociation des sous-unités et/ou un relâchement de la structure. Suite à ce constat, nous avons voulu obtenir la structure de ce filament in cellulo par cryo-tomographie. Afin d’augmenter le contraste des tomogrammes et de palier aux limitations technologiques du microscope, nous avons mis au point un procédé permettant d’affiner les cellules S. pneumoniae en utilisant une enzyme PAL provenant du phage lytique DP1. Nous avons montré par cette méthode que l’intégrité structurale de la membrane de ces bactéries lysées était conservée et que l’augmentation du contraste par l’affinement rendait possible l’observation de structure internes ou externes précédemment invisibles. Cette méthode permettra la visualisation du pilus de transformation in situ par cryo-tomographie. La seconde thématique est l’étude des pili de type IV. Ces filaments sont retrouvés à la surface d’un large éventail de bactéries à Gram-positif et à Gram-négatif. Ces filaments ont des fonctions diverses et variées qui sont essentielles à la physiologie des bactéries (adhésion, motilité…). Au cours de ces deux dernières décennies, plusieurs structures de ces filaments ainsi que de leurs composants ont pu être obtenus. Ses études structurales ont permis de fournir une meilleure compréhension du fonctionnement des pili ainsi que de leur mécanisme d’assemblage. Cependant, l’ensemble de ces connaissances ont été relevées chez des bactéries à Gram-négatif. Jusqu'à présent aucune structure de filament de type IV issu d’une bactérie à Gram-positif n’avait été encore résolue.Nous nous sommes intéressés au filament de type IV d’une bactérie à Gram-positif : Streptococcus sanguinis. Après purification de ce filament et analyse de ce dernier par cryo-microscopie électronique, nous avons pu décrire pour la première fois la structure d’un filament de type IV issu d’une bactérie à Gram-positif.La dernière partie de cette thèse, plutôt d’ordre technologique, consistait à mettre en place, au sein de notre laboratoire et plus généralement sur le campus de Bordeaux, la cryo-microscopie corrélative. Ce type de technique permet de combiner l’information de localisation obtenue par la microscopie à fluorescence avec la haute résolution fournie par la microscopie électronique. Au cours de ce projet, nous avons dû dépasser plusieurs limites et effectuer de nombreuses optimisations afin d’implémenter cette méthode. Cette mise en place nous a permis de participer à plusieurs projets collaboratifs dont l’un où nous avons décrit pour la première fois l'observation de synapses dopaminergiques par cryo-tomographie.

The work of this thesis has been focused on three main topics.The first part focuses on the pili involved in bacterial transformation. During this process, bacteria capture and incorporate exogenous DNA from their environment, promoting genetic plasticity and adaptability. Bacterial transformation allows many human pathogens to acquire resistance to antibiotics and/or to escape vaccines through the incorporation of new genes. It has been previously demonstrated in Streptococcus pneumoniae that the first step of this process, the capture of DNA from outside the bacterium, is performed by a type IV pilus-like filament exposed on the surface of the bacterium: the transformation pilus.The objective of this project is to solve the structure of this filament, previously unknown, in two model streptococci: Streptococcus pneumoniae and Streptococcus sanguinis.The transformation pilus was purified by different methods. We obtained a preliminary low-resolution structure of the transformation pilus of S. pneumoniae using cryo-electron microscopy. During this study, we also demonstrated a change in the morphology of the filament after purification, suggesting that its release from the cell surface induces a possible dissociation of the subunits and/or a relaxation of the structure. Following this observation, we wanted to obtain the structure of this filament in cellulo by cryo-tomography. In order to increase the contrast of the tomograms and to overcome technical limitations of the microscope, we developed a process to thin the S. pneumoniae cells using a PAL enzyme from the lytic phage DP1. We have shown that the structural integrity of the membrane of these lysed bacteria is preserved and that the increase in contrast by thinning makes it possible to observe internal or external structures previously invisible. This method will allow the visualization of the transformation pilus in situ by cryo-tomography.The second theme is the study of type IV pili in Gram-positive bacteria. These filaments are found on the surface of a wide range of Gram-positive and Gram-negative bacteria. They have various functions that are essential to the physiology of bacteria (adhesion, motility...). During the last two decades, several structures of these filaments and their components have been obtained. These structural studies have provided a better understanding of the functioning of these pili as well as their assembly mechanism. However, all of this knowledge has been obtained in Gram-negative bacteria. Until now, no type IV filament structure from a Gram-positive bacterium had been solved.We are interested in the type IV filament of a Gram-positive bacterium: Streptococcus sanguinis. After purification of this filament and its analysis by cryo-electron microscopy, we were able to describe for the first time the structure of a type IV filament from a Gram-positive bacterium.The last part of this thesis consisted in setting up, within our laboratory and more generally on the Bordeaux campus, the correlative cryo-light electron microscopy workflow (CryoCLEM). This methodology allows to combine the localization information obtained by fluorescence microscopy with the high resolution provided by electron microscopy. During this project we had to overcome several limitations and perform many optimizations in order to implement this method. This implementation allowed us to participate in several collaborative projects, one of which described for the first time the observation of dopaminergic synapse by cryo-tomography.