Identification et ciblage thérapeutique d'ARNs non-codants et leurs interacteurs protéiques

Identification and targeting of functional non-coding RNA–protein interactions

• Auteur / Autrice : Xavier Sabaté Cadenas
• Direction : Alena Shkumatava
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Soutenance le 19/09/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génétique et biologie du développement (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Lionel Larue
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alena Shkumatava, Clément Carré, Ramesh Pillai, Reini Luco, Shahad Albadri
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Clément Carré, Ramesh Pillai

Mots clés

Mots clés libres

Interaction ARN-Protéine

LncARN

Mélanome

Découverte de médicaments

RNA-Protein interactions

LncRNA

Melanoma

Drug discovery

Résumé

L'importance des interactions ARN-protéines dans la biologie du cancer a été de plus en plus reconnue au cours des dernières années. Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) régulent la maturation, la stabilité et la localisation subcellulaire des transcrits d'ARN, et sont également les moteurs de la fonction des ARN non codants impliqués dans de multiples processus biologiques. En outre, les interactions ARN-RBP sont apparues comme des régulateurs de l'oncogenèse et donc comme des cibles thérapeutiques potentielles.Le long ARN non codant (lncRNA) humain CASC15 a été signalé comme étant dérégulé dans le mélanome métastatique humain. Notre laboratoire a récemment identifié son orthologue chez le poisson zèbre, dont la séquence primaire est peu conservée au cours de l'évolution. À l'aide d'un modèle inductible de cancer de la peau chez le poisson zèbre, qui correspond étroitement au processus humain, nous avons démontré que CASC15 chez le poisson zèbre atténue l'initiation et la progression du mélanome. Ainsi, l'expression de CASC15 humain chez le poisson zèbre mutant pour ce lncRNA permet le sauvetage du phénotype de progression du mélanome. Nous supposons que chez les deux orthologues, les mêmes interactions ARN-RBPs expliquent leur conservation fonctionnelle. Dans mon premier projet, j'ai étudié le mécanisme d'action moléculaire de CASC15 dans une lignée cellulaire humaine. Comme pour le poisson zèbre, la délétion de CASC15 dans les cellules de mélanome humain accélère leur migration. De plus, en combinant différentes approches moléculaires et biochimiques, j'ai identifié un ensemble d'interacteurs protéiques commun chez les orthologues de CASC15 qui conduisent à leur conservation fonctionnelle. Ces résultats mettent en lumière la relation entre le mécanisme d'action et la compatibilité fonctionnelle entre les lncRNA de différentes espèces animales divergentes au niveau de leur séquence.En parallèle, j'ai également étudié YTHDF2, une RBP impliquée dans de multiples cancers humains. Cette protéine reconnaît une marque de méthylation présente dans des transcrits d'ARN spécifiques qui régule leur stabilité. La délétion de YTHDF2 empêche l’apparition et le développement de la leucémie aiguë myéloïde tout en préservant l'hématopoïèse normale in vivo. En raison de cette spécificité cancéreuse, YTHDF2 est apparu comme une cible thérapeutique unique. Cependant, l'identification de petites molécules qui ciblent les interactions ARN-RBPs dans les cellules est actuellement limitée par l'absence de méthodes de criblage non biaisées. Dans mon deuxième projet, j'ai adapté notre technologie d'interaction ARN-RBPs à une plateforme de criblage de médicaments. J'ai identifié plusieurs composés approuvés par la FDA qui inhibent spécifiquement la liaison de YTHDF2 à ses ARN cibles et j'ai établi la procédure pour contrôler la spécificité des résultats identifiés. Afin de trouver de nouvelles molécules, j'ai appliqué un crible computationnel basé sur les ligands identifiés ainsi que des fragments de ces derniers. L’ensemble de ce travail démontre que la protéine YTHDF2 peut être traitée par des médicaments et corrobore la fiabilité de notre méthode pour l'identification d'inhibiteurs ciblant des interactions ARN-RBPs spécifiques.En conclusion, j'ai établi des modèles in vivo, des systèmes cellulaires et des outils moléculaires robustes, menant à l'identification et au ciblage d'interactions fonctionnelles ARN-RBPs ayant des rôles cruciaux dans les cancers humains.

The importance of RNA-protein interactions in cancer biology has been increasingly acknowledged in the past years. RNA-binding proteins (RBPs) regulate the maturation, stability, and subcellular localization of RNA transcripts. RBPs are also the drivers of the function of long non-coding RNAs implicated in multiple biological processes. In addition, RNA-RBP interactions have arisen as regulators of tumorigenesis and therefore as potential therapeutic targets.The human long non-coding RNA (lncRNA) CASC15 has been reported to be dysregulated in human metastatic melanoma. Our laboratory recently identified its zebrafish ortholog, whose primary sequence is poorly conserved throughout evolution. Using an inducible zebrafish skin cancer model that closely parallels the human process, we demonstrated that the zebrafish casc15 attenuates melanoma initiation and progression. Importantly, the expression of human CASC15 in the zebrafish lncRNA mutant rescued the melanoma progression phenotype. We hypothesized that the same RBP interactions in both orthologous transcripts underlie their functional conservation. In my first project, I investigated the molecular mechanism of action of CASC15 in a human cell line. Similar to zebrafish, the depletion of CASC15 in human melanoma cells mutant increases their migration behavior. In addition, by combining different molecular and biochemical approaches, I identified a common set of functional protein interactors that drive the functional conservation of CASC15 orthologs. These findings shed light on the relationship between mechanism of action and functional compatibility between lncRNA from different animal species divergent in sequence.In parallel, I also studied YTHDF2, an important RBP implicated in multiple human cancers. This protein recognizes an abundant methylation mark present in specific RNA transcripts and regulates their stability. YTHDF2 knockout compromises leukemic stem cells while preserving normal hematopoiesis in vivo. Because of this cancer-specificity property, YTHDF2 has emerged as a unique therapeutic target. However, the identification of small molecules that target RNA-protein interactions in cell is currently limited by the absence of unbiased scalable screening methods. In my second project, I have adapted our RNA-protein interaction technology to a drug screening platform. I identified several FDA-approved compounds that specifically inhibit YTHDF2 binding to its target RNAs and established the pipeline to control for the specificity of the identified hits. In order to find novel small molecule inhibitors, I expanded the collection of tested drugs by following a ligand-based computational screen as well as including fragments of the hit compounds. In conclusion, this work demonstrates that YTHDF2 protein is druggable and corroborates the reliability of our method to be used for the identification of inhibitors targeting specific RNA-protein interactions.Together, I have established in vivo models, cellular systems, and robust molecular tools, leading to the identification and targeting of functional RNA-RBP interactions with crucial roles in human cancers.