Nanoparticules d’oxyde de fer recouvertes de polymères zwitterioniques pour la micromanipulation de chromosomes dans le noyau de cellules vivantes

Iron oxide nanoparticles coated with zwitterionic polymers for micromanipulation of chromosomes in live cells

• Auteur / Autrice : Fanny Delille
• Direction : Thomas Pons, Nicolas Lequeux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Frontières du vivant
• Date : Soutenance le 12/10/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de physique et d’étude des matériaux (Paris ; 2010-....) - Laboratoire de Physique et d'Etude des Matériaux (UMR 8213)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la Ville de Paris (1882-....)
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Bégin-Colin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thomas Pons, Nicolas Lequeux, Christine Ménager, Andreas Reisch, Laurence Motte
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christine Ménager, Andreas Reisch

Mots clés

Mots clés libres

Nanoparticules d’oxyde de fer

Zwitterion

Ligands de surface polymériques

Bioconjugaison

Micromanipulation

Physique de la chromatine

Iron oxide nanoparticles

Zwitterion

Polymeric surface ligands

Bioconjugation

Micromanipulation

Physics of chromatine

Résumé

Dans le noyau des cellules, l’ADN est replié selon une architecture complexe multi échelle. Notre compréhension des principes physiques qui régissent cette organisation complexe n’est pas complète. Pour l’étudier, il serait utile de pouvoir appliquer directement une force sur les chromosomes in vivo. Dans cette thèse est présentée une nouvelle nanosonde magnétique qui peut s’accrocher à un locus génomique précis et y appliquer une force.Cette nanosonde est une nanoparticule d’oxyde de fer recouverte de ligands polymériques. Le premier défi est d’éviter les interactions non spécifiques entre les nanoparticules et des biomolécules dans l’environnement intranucléaire très encombré. Pour y parvenir, nous avons conçu un copolymère à bloc pour recouvrir les nanoparticules. Le premier bloc contient des zwitterions sulfobétaïne qui sont très efficaces pour éliminer les interactions non spécifiques. Le second bloc contient plusieurs groupes phosphonates qui permettent l’accroche des polymères sur la surface de la nanoparticule. La stabilité de l’accroche sur le long terme et l’absence d’interactions entre des protéines et le revêtement polymérique choisi a été étudiée in vitro et dans des cellules vivantes.Le deuxième défi est de conjuguer des protéines spécifiques à la nanoparticule qui vont permettre de cibler les séquences d’ADN choisies. Nous avons optimisé la conception du polymère pour atteindre une conjugaison contrôlée et efficace des protéines de ciblage sur la surface des nanoparticules, par chimie click sans catalyseur cuivre. Les nanoparticules sont fonctionnalisées avec de la protéine fluorescente verte (GFP), qui se lie dans le noyau à un nanocorps anti-GFP, fusionné à une protéine qui se lie à une séquence d’ADN spécifique dans le modèle cellulaire utilisé.L’efficacité du ciblage des nanoparticules sur l’ADN a été étudiée après microinjection d’une solution de nanoparticules dans le noyau de cellules vivantes. Le ciblage est rapide, de l’ordre de plusieurs minutes, et spécifique, et les interactions non spécifiques sont évitées. Des milliers de nanoparticules se lient au locus génomique. Le locus a été manipulé avec une pointe magnétique qui produit un fort gradient de champ. Le locus est soumis à une force de l’ordre du piconewton qui peut déplacer le locus génomique sur plusieurs micromètres. Cet outil sera utile pour étudier la mécanique des chromosomes, et l’organisation et les fonctions du génome.

In a cell nucleus, the genome is folded in a complex architecture. Our understanding of the physical principles responsible for this complex organization is still limited. It would be useful to be able to directly exert and measure forces on chromosomes in vivo to study these questions. In this project, we present a novel magnetic nanoprobe that can bind to a specific genomic locus and apply a force to this locus.This nanoprobe is an iron oxide nanoparticle coated with specific polymeric ligands. The first challenge lies in avoiding nonspecific interactions between the nanoprobes and biomolecules in the very crowded intranuclear environment. To achieve this, we have designed a specific diblock copolymer to coat the nanoparticles. The first block contains sulfobetaine zwitterions that are very efficient to eliminate nonspecific interactions. The second block contains multiple phosphonate anchoring groups to ensure long term anchoring stability. The anchoring stability of the polymer to the nanoparticle surface has been checked and the absence of interactions with proteins with the selected polymer coating has been assessed in vitro and in live cells.The second challenge is to conjugate specific proteins that will enable the targeting of selected DNA sequences. We have optimized the design of the polymer architecture to achieve controlled and efficient binding of targeting proteins to the surface of our nanoparticles, via copper-free click chemistry. Here we functionalize our nanoparticles with fluorescent dyes for visualization and with GFP, which will bind to an anti-GFP nanobody domain, fused to a fluorescent protein and a domain that binds a specific DNA sequence in our cell model.The efficiency of the targeting has been assessed after microinjection of the nanoparticle solution in the nucleus of living cells. It is quick and specific, without nonspecific interactions. Thousands of nanoparticles can bind the genomic locus. Manipulation of the genomic locus has been performed with a magnetic tip that produces a strong magnetic field gradient. In this gradient, the locus is submitted to a force on the piconewton range that can move the genomic locus over several micrometers. This tool will be helpful to study chromosome mechanics and genome functions.