Imagerie de la transcription dans les embryons vivants pour comprendre la mise en place de l’identité des cellules au cours du développement et sa robustesse

Imaging transcription in living embryos to decipher the robustness of patterning

• Auteur / Autrice : Gonçalo Fernandes
• Direction : Nathalie Dostatni
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique et génomique
• Date : Soutenance le 29/09/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dynamique du noyau (Paris ; 2014-....) - Dynamique du noyau [Institut Curie]
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Denis Thieffry
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nathalie Dostatni, Hilary Ashe, Samir Merabet, Wolfgang KEIL, Mounia Lagha
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Hilary Ashe, Samir Merabet

Mots clés

Mots clés libres

Transcription

Modelage Biophysique

Gradient morphogénique

Bicoid-Hunckback

Acquisition de l'identité cellulaire

Transcription

Biophysical modelling

Morphogen gradient

Bicoid-Hunchback

Acquisition of cell identity

Résumé

Au cours du développement, les gradients morphogénétiques fournissent l’information positionnelle nécessaire à l’établissement des axes de polarité. Si l’importance de ces gradients est bien établie, la façon dont ils assurent la reproductibilité des patrons d’expression malgré la nature stochastique de la transcription reste énigmatique.Pour répondre à cette question, j’étudie l’établissement de l’axe antéro-postérieur (AP) de l’embryon de drosophile, sous contrôle de Bicoid (Bcd), un facteur de transcription et morphogène bien connu. Les ARNs de bcd sont exprimés maternellement et ancrés au pôle antérieur de l’ovocyte. Après la ponte, ces ARNs sont traduits en protéines, qui diffusent dans le cytoplasme pour former un gradient de concentration exponentiel avec son maximum au pôle antérieur. Un modèle simple propose que le destin de chaque cellule le long de l’axe est déterminé par la concentration de Bcd qu’elle reçoit. Toutefois, de nombreux débats ont remis en question la possibilité que les patrons d’expression induits par Bcd résultent uniquement des propriétés de diffusion et d’interaction des protéines Bcd avec leurs séquences cibles.L’objectif de ma thèse était de comprendre le rôle précis de Bcd dans l’expression de son gène cible principal, hunchback (hb). Pour cela, j’ai adapté à des gènes rapporteurs synthétiques, le système MS2-MCP, qui permet l’étiquetage fluorescent des ARN et l’analyse quantitative de la dynamique transcriptionnelle avec une forte résolution spatio-temporelle dans les embryons vivants. Dans ces rapporteurs, la séquence MS2 est contrôlée par un promoteur minimal contenant aussi les sites de fixation pour Bcd ou ses partenaires, Hb et Zelda (Zld), seul ou en combinaison. Mon but était de déterminer comment les divers rapporteurs récapitulent l’expression du promoteur d’hb et d’identifier les rôles spécifiques de chacun de ces facteurs et leurs interactions dans le mécanisme de transcription.De façon intéressante, l’expression du rapporteur avec uniquement neuf sites pour Bcd (trois de plus que dans le gène hb) récapitule l’expression du rapporteur hb-MS2, mais de façon moins rapide et avec un domaine d’expression à la bordure moins nette. Cela suggère qu’en définissant la position de la bordure mais pas sa netteté ni la rapidité de son établissement, Bcd est la source principale d’information positionnelle.En outre, la fixation des partenaires de Bcd au promoteur accélère le processus en agissant à différentes étapes : i) Hb agit en synergie avec Bcd en réduisant les fluctuations du promoteur et en augmentant le taux de démarrage de la polymérase ; ii) Zld abaisse le seuil de concentration de Bcd nécessaire à l’activation par Bcd. En collaboration avec des physiciens, nous avons développé un modèle de transcription impliquant Bcd et fournissant un contexte théorique aux données expérimentales. Ce modèle montre que l’établissement rapide de la bordure d’expression d’hb peut être expliqué par une réaction d’équilibre entre Bcd et ses sites de fixation pour l’information positionnelle nécessitant Zld et Hb pour sa dynamique temporelle.Pour confirmer que Bcd est la seule source d’information positionnelle du système, j’ai comparé la position de la bordure d’expression des gènes rapporteurs dépendant uniquement de Bcd dans des embryons exprimant une ou une demi-dose de Bcd. De manière surprenante, pour chaque rapporteur, le déplacement de la bordure est plus faible que son estimation théorique tenant compte de la constante du gradient exponentiel de concentration de Bcd. Cela indique une constante plus faible pour le gradient d’activité de Bcd et suggère l’existence de sous-populations de Bcd, avec certaines molécules moins actives que d’autres. L’amplitude du déplacement de la bordure du gène rapporteur hb-MS2 est la même que celle obtenue pour les rapporteurs dépendant uniquement de Bcd ce qui confirme que Bcd est bien la seule source d’information positionnelle pour l’expression d’hb.

Morphogen gradients provide concentration-dependent positional information required to establish the polarity of developmental axes. Although the critical role of these gradients is well recognized, it is unclear how they provide reproducible expression patterns. This is particularly surprising if we consider the stochastic nature of transcription.To address this question, I focus on the establishment of the anterior-posterior (AP) axis of fruit fly embryos, which is mostly defined by Bicoid (Bcd), a very well-characterized morphogen and transcription factor. bcd mRNAs are expressed maternally and anchored at the anterior tip of the oocyte. After egg laying, these mRNAs are translated into proteins, which diffuse through the cytoplasm and form a gradient with its highest concentration at the anterior. A simple model is that depending on their position along the AP axis and thus on Bcd concentration, cells will adopt different fates. However, long debates in the field have questioned the possibility that Bcd-dependent transcription patterns emerge solely from diffusive biochemical interactions between limiting amounts of Bcd molecules and the gene promoter region.The goal of my PhD was to determine how Bcd precisely regulates expression of its main target gene, hunchback (hb). For this, I adapted to synthetic reporters the MS2-MCP system, which allows the fluorescent tagging of mRNAs and provides, thus, a quantitative analysis of transcription dynamics at high spatiotemporal resolution in living embryos. In these reporters, the MS2 sequence was placed under the control of a minimal promoter also containing DNA binding sites for Bcd and/or its known partners, Hb and Zelda (Zld), either alone or in combination. My goal was to determine how the various reporters could recapitulate expression of the hb promoter (hb-MS2 reporter) and shed light on the specific roles of the different factors and their interactions in the transcription mechanism.Interestingly, expression of the reporter with only nine Bcd binding sites (three more than in the hb gene) matches almost perfectly the hb-MS2 reporter pattern, except for the very high steepness of the expression domain boundary and the speed to reach steady-state. This suggests that Bcd alone is the main source of positional information, defining the positioning of the boundary but not its steepness nor the speed of its establishment.In addition, binding of Bcd’s partners to the promoter speed-up the process by acting in different steps of the transcription mechanism: i) Hb synergizes with Bcd by reducing transcription burstiness and increasing the polymerase firing rate; ii) Zld lowers the Bcd concentration threshold required for Bcd-dependent expression. In collaboration with physicists, a biophysical model of Bcd-dependent expression was developed providing a theoretical framework for the experimental data. This model showed that the very rapid establishment of the hb expression boundary can be solely explained by an equilibrium model involving the binding of Bcd molecules to their DNA-binding sites for positional information which requires Zld and Hb for its temporal dynamics.To further confirm that Bcd is the sole source of positional information for hb expression, I compared the boundary position of the Bcd-only dependent reporters in embryos expressing one dose or half dose of Bcd. Surprisingly, the corresponding shifts of these reporters’ boundaries upon one vs half dose of Bcd were smaller than theoretically expected given the measured decay length of the Bcd protein gradient. This indicates a shorter decay length for the Bcd activity gradient and suggests the existence of different Bcd populations, with some Bcd molecules being less active than others. Importantly, the shift observed for the hb-MS2 reporter was the same as for the Bcd-only dependent reporters confirming Bcd as the sole source of positional information for hb expression.