Etude des mécanismes d’export des ribonucléocapsides du Virus Respiratoire Syncytial

Study of the export mechanisms of respiratory syncytial virus ribonucleocapsids

• Auteur / Autrice : Gina Cosentino
• Direction : Marie-Anne Rameix-Welti, Elyanne Gault
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 31/03/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Infection et inflammation (2I)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université de Versailles-Saint-Quentin-en-Yvelines (1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Cédric Delevoye
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sandie Munier, Raphaël Gaudin, Marie Galloux
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sandie Munier, Raphaël Gaudin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ribonucléoprotéines

Endosomes

Virus respiratoire syncytial humain

Mots clés libres

Mononegavirales

Ribonucleoproteine virale

Virus respiratoire syncytial

Génétique inverse

Microscopie sur cellules vivantes

Trafic intracellulaire

Live microscopy

Intracellular trafficking

Respiratory syncytial virus

Viral ribonucleoprotein

Reverse genetic

Mononegavirales

Résumé

Principal agent de la bronchiolite du nourrisson, le virus respiratoire syncytial (RSV) est responsable d’infections respiratoires sévères chez les enfants mais aussi chez les sujets âgés ou fragilisés. En dépit de son importance en santé publique, il n’existe à ce jour aucun vaccin ni traitement antiviral curatif contre le RSV. Dans ce contexte, une meilleure connaissance de ses mécanismes de réplication est essentielle pour proposer de nouvelles stratégies antivirales. Le RSV est un virus enveloppé à ARN négatif simple brin dont le cycle de réplication est exclusivement cytoplasmique. Les étapes de synthèse des ARN viraux ont lieu au sein d’inclusions cytoplasmiques appelées corps d’inclusion ou IBs. Lors de la réplication, les génomes néosynthétisés sont encapsidés par les protéines N et associés au complexe polymérase formant ainsi les ribonucléoprotéines virales (RNP). Ces RNPs rejoignent ensuite la membrane plasmique où ont lieu les étapes d’assemblage et de bourgeonnement. Les RNPs sont des objets volumineux qui ne peuvent pas diffuser librement dans le cytoplasme, mais les voies cellulaires impliquées dans leur transport restent inconnues à ce jour.Pour étudier le trafic des RNPs néosynthétisées, nous avons produit un virus recombinant exprimant une N fluorescente ce qui permet de visualiser pour la première fois les RNPs dans des cellules vivantes et d’analyser leurs trajectoires. Une majorité des RNPs présentent des mouvements de type brownien mais d’autres sont animés de mouvements rectilignes et rapides de l’ordre de 2µm/s évoquant un transport sur les microtubules. Nous avons en effet visualisé les mouvements des RNPs sur les microtubules marqués. La dépolymérisation des microtubules entraine un arrêt total des mouvements rapides des RNPs confirmant leur implication dans ces transports. De plus, lors de ces mouvements rapides les RNPs sont associées à Rab11, un marqueur de l’endosome de recyclage. L’observation des mouvements des RNPs et des vésicules Rab11 positives montrent en effet des RNPs animées de mouvement rapides qui semblent tirées par Rab11. La vitesse des RNPs et la distance qu’elles parcourent sont diminuées lors de l’inhibition transitoire de l’expression de Rab11a. Enfin des expériences d’immunoprécipitation mettent en évidence une interaction entre Rab11a et les RNPs. En conclusion, nos résultats démontrent que les RNPs du RSV utilisent les microtubules pour se déplacer en détournant la voie de recyclage des endosomes.

Respiratory syncytial virus (RSV) is the main agent of infant bronchiolitis and is responsible for severe respiratory infections for children, but also for elderly or frail subjects. Despite its importance in public health, there is currently no vaccine or curative antiviral treatment against RSV. In this context, a better understanding of its replication mechanisms is essential to propose new antiviral strategies. RSV is an enveloped single-stranded negative RNA virus with an exclusively cytoplasmic replication cycle. The synthesis steps of viral RNAs take place within cytoplasmic inclusions called inclusion bodies or IBs. During replication, the neosynthesized genomes are encapsidated by N proteins and associated with the polymerase complex forming viral ribonucleoproteins (RNPs). These RNPs then reach the plasma membrane where the assembly and budding steps take place. RNPs are bulky objects that cannot freely diffuse into the cytoplasm, but the cellular pathways involved in their transport remain unknown to date.To study the trafficking of neosynthesized RNPs, we produced a recombinant virus expressing a fluorescent N, which allows us to visualize for the first time RNPs in living cells and to analyze their trajectories. A majority of RNPs show Brownian-like movements but others are animated by rectilinear and fast movements of the order of 2µm/s evoking a transport on microtubules. We have indeed visualized the movements of RNPs on labeled microtubules. The depolymerization of microtubules leads to a total stop of the fast movements of RNPs confirming their involvement in these transports. Moreover, during these rapid movements, RNPs are associated with Rab11, a marker of the recycling endosome. The observation of RNPs movements and Rab11 positive vesicles show indeed RNPs animated by fast movements which seem to be pulled by Rab11. The speed of RNPs and the distance they travel at are decreased upon transient inhibition of Rab11a expression. Finally, immunoprecipitation experiments show an interaction between Rab11a and RNPs. In conclusion, our results demonstrate that RSV RNPs use microtubules to move by hijacking the endosome recycling pathway.