Étude des modifications de méthylation de l'ADN : des dynamiques au cours de la dédifférenciation en cellules souches cancéreuses de sein, au développement de l'outil ABSP, Analysis of Bisulfite Sequencing PCR, sous R

Study of DNA methylation modifications : from dynamics during the dedifferentiation into breast cancer stem cells, to the development of the R-based tool ABSP, analysis of bisulfite sequencing PCR

• Auteur / Autrice : Marie Denoulet
• Direction : Chann Lagadec
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 31/10/2022
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École graduée Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Hétérogénéité, plasticité et résistance aux thérapies des cancers (CANTHER)
• Jury : Président / Présidente : Xuefen Le Bourhis
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michelina Plateroti, Audrey Vincent
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Thierry Virolle, Marc Cuggia

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bioinformatique

Reprogrammation cellulaire

Méthylome

Méthylation

ADN

Radiorésistance

Cancer du sein

Mots clés libres

Cellules souches cancéreuses

Séquençage au bisulfite

R (langage)

Breast cancer

Radiotherapy

Cancer stem cells

DNA methylation

Bisulfite sequencing

R language

Résumé

Les Cellules Souches Cancéreuses (CSC) forment une sous-population tumorale caractérisée par des capacités d'auto-renouvellement, de pluripotence, d'initiation tumorale et présentent une résistance thérapeutique accrue. Elles sont donc une cause majeure de récidive du cancer. De plus, les cellules cancéreuses non-souches sont capables de se dédifférencier en CSC en réponse à un stress, notamment aux traitements anticancéreux comme la radiothérapie, renforçant ainsi la résistance thérapeutique de la tumeur. Nous avons fait l'hypothèse que les marques épigénétiques telles que la méthylation de l'ADN, connues comme contribuant à la régulation des propriétés souches, seraient impliquées dans la réacquisition d'un phénotype CSC.Afin d'évaluer les modifications de méthylation de l'ADN au cours de la dédifférenciation radio-induite des cellules non-CSC en CSC dans le modèle de cancer du sein, une analyse de Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) des différentes sous-populations tumorales a été réalisée. Cette analyse a permis d'identifier plus de 2 000 régions différentiellement méthylées (DMR) subissant des changements de méthylation entre les états non-CSC et CSC radio-induit. Nous avons retenu 35 DMR présentant un profil de méthylation cohérent avec une potentielle contribution à la dédifférenciation radio-induite. Cinq d'entre elles, associées aux gènes FSCN1, CHRNA6, CDH7, CD9 et PRKAR1B, ont été sélectionnées pour validation complémentaire. Les gènes régulés par ces changements de méthylation pourraient servir de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'inhiber spécifiquement la conversion phénotypique de non-CSC à CSC et prévenir un enrichissement de la tumeur en CSC, réduisant ainsi le risque de rechute du cancer.Pour valider les différences de méthylation observées en RRBS, la méthode de Bisulfite Sequencing PCR (BSP) a été choisie pour son accessibilité et son efficacité à quantifier les niveaux de méthylation d'un locus spécifique. En raison de l'absence d'outils à ce jour permettant d'analyser efficacement et de manière automatisée les résultats de BSP, provenant des deux approches de BSP (direct-BSP et cloning-BSP), nous avons donc fait le choix de développer sous R un nouvel outil, ABSP pour « Analysis of Bisulfite Sequencing PCR ». ABSP fournit une analyse complète, automatisée et accessible pour calculer les pourcentages de méthylation et comparer les différences de méthylation entre échantillons. ABSP et ses données associées sont téléchargeables à l'adresse https://github.com/ABSP-methylation-tool/ABSP. Ainsi, ce travail a mis en lumière l'importance de la méthylation de l'ADN dans la plasticité du phénotype souche cancéreux et le potentiel d'amélioration des outils d'analyse.

Cancer stem cells (CSCs) form a tumoral subpopulation characterized by self-renewal abilities, pluripotency, therapeutic resistance mechanisms, and tumor initiation capacities, and are therefore a major cause of cancer recurrence after treatments. Moreover, the non-cancer stem cells (non-CSCs) are able to dedifferentiate into CSCs, in response to stress, especially to antitumor treatments such as radiotherapy, thus reinforcing the therapeutic resistance of cancer. In addition, epigenetic marks such as DNA methylation are known to contribute to the regulation of stemness properties and could be involved in the reacquisition of a CSC phenotype.To evaluate DNA methylation modifications occurring throughout the radio-induced dedifferentiation of non-CSCs into CSCs in the breast cancer model, a Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) analysis of the different tumor subpopulations was carried out. The analysis of RRBS data led to the identification of over 2,000 Differentially Methylated Regions (DMRs) undergoing methylation changes from non-CSC to radio-induced CSC. Among them, 35 present a methylation profile across the populations consistent with a potential contribution to radio-induced dedifferentiation. Five regions, associated with the FSCN1, CHRNA6, CDH7, CD9, and PRKAR1B genes, were selected for further validation. Genes regulated by these methylation changes could serve as new therapeutic targets to specifically inhibit the non-CSC to CSC phenotypic switch and prevent the enrichment in CSCs, reducing the risk of cancer relapse.To validate identified methylation differences, the Bisulfite Sequencing PCR (BSP) method was chosen as it is the most convenient and accessible technique to quantify locus-specific methylation levels. Due to a lack of efficient tools to analyze BSP results from both approaches (direct-BSP and cloning-BSP), the ABSP R-based tool, standing for Analysis of Bisulfite Sequencing PCR, was developed. This tool provides a complete, automated, and user-friendly workflow to compute methylation percentages and compare methylation differences between samples. ABSP is available for download, along with associated data, at https://github.com/ABSP-methylation-tool/ABSP. Altogether, this work highlights the importance of DNA methylation within CSC plasticity and the room for tools to improve its analysis.