Caractérisation structurale du mécanisme de sauvetage de la synthèse des protéines chez les bactéries

Structural characterization of the rescue mechanism of proteins synthesis in bacteria

• Auteur / Autrice : Gaetano D'Urso
• Direction : Reynald Gillet, Emmanuel Giudice
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et structurale, biochimie
• Date : Soutenance le 20/10/2022
• Etablissement(s) : Rennes 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Nantes)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Génétique et Développement de Rennes (UMR 6290)
• Jury : Président / Présidente : Luc Paillard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Irmgard Sinning
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Emmanuelle Schmitt, Stefano Marzi

Mots clés

Mots clés contrôlés

Synthèse protéique

Ribonucléases

ARN transfert-messager

Cryomicroscopie

Mots clés libres

Cryo-EM

Trans-Traduction

ARNtm

SmpB

RNase R

Bs1

Cryo-EM

Trans-Translation

TmRNA

SmpB

RNase R

Bs1

Résumé

Le présent travail effectué au cours de cette thèse se concentre sur le mécanisme le plus important impliqué dans le contrôle de la qualité de la synthèse des protéines bactériennes, appelé trans-traduction. La trans- traduction est essentielle pour la survie des cellules bactériennes car elle permet le sauvetage des ribosomes bloqués sur l'ARNm non-stop pendant la traduction, permettant leur recyclage avec la dégradation simultanée du messager défectueux et la dégradation de la chaîne polypeptidique naissante non fonctionnelle. Les deux principaux acteurs impliqués dans ce processus sont l'ARN transfert-messager (ARNtm), une molécule d'ARN chimérique capable de jouer à la fois le rôle d'un ARNt et d'un ARNm, et son partenaire la petite protéine basique B (SmpB), qui est essentielle pour la liaison au ribosome, le positionnement correct du codon de reprise et l'expulsion de l'ARNm non-stop du ribosome. Dans a première section de ce manuscrit, nous expliquons l'étude structurale, par cryo-EM, du processus de trans-traduction qui nous a permis de reconstruire quatre structures atomiques à haute résolution du ribosome dans quatre différentes étapes consécutives de ce mécanisme (pré- accommodation, accommodation, translocation et post-translocation). De cette façon, nous avons pu mettre en évidence les interactions moléculaires au niveau atomique qui sont essentielles à l'ensemble du processus et qui sont particulièrement intéressantes car elles peuvent être utilisées comme cibles contre lesquelles de nouvelles molécules à activité antibactérienne peuvent être développées. Dans la deuxième partie du travail, nous avons concentré notre attention sur la caractérisation structurelle d'un troisième composant impliqué dans la trans-traduction, connu sous le nom de RNase R. La RNase R est une ribonucléase essentielle pour la dégradation de l'ARNm non-stop. Il a été observé qu'elle entre en compétition avec l'ARNtm pour le même site de liaison sur le ribosome, et qu'elle est très dynamique lorsqu'elle interagit avec le ribosome lui-même. Pour cette raison, l'étude a été étendue à un système plus complexe dans lequel nous avons cherché à comprendre le rôle exact des trois acteurs (ARNtm, SmpB et RNase R) lors du décrochage de deux ribosomes sur le même ARNm défectueux (disomes). Cette étude est toujours en cours. Dans le dernier chapitre, nous avons décrit une nouvelle conformation particulière pour l'une des protéines les plus importantes du ribosome, connue sous le nom de bS1. Cette protéine est essentielle dans les premières étapes de la traduction. Dans ce cas, l'un de ses six domaines, normalement connu pour être impliqué dans l'interaction avec le ribosome, présente une conformation particulière qui lui permet d'interagir avec la portion Shine-Dalgarno de l'ARNm, stabilisant ainsi sa liaison avec son homologue à l'extrémité 3' de l'ARNr 16S. Cette observation pourrait ouvrir la porte à une meilleure compréhension du mécanisme d'action de cette protéine.

The present work carried out in the course of this PhD is focused on the most important mechanism involved in the quality control of bacterial protein synthesis, called trans-translation. trans-translation is essential for bacteria cell survival as it allows the rescue of stalled ribosomes on non-stop mRNA during the translation, enabling their recycling with simultaneous degradation of the defective messenger and degradation of the non-functional nascent polypeptide chain. The two main players involved in this process are the transfer-messenger RNA (tmRNA), a chimeric RNA molecule capable of playing the role of both a tRNA and an mRNA, and its partner the small basic protein B (SmpB), which is essential for the ribosome binding, the correct positioning of the resume codon and the expulsion of non-stop mRNA from the ribosome. In the first section of this manuscript, we explain the structural study, by cryo- EM, of the trans-translation process that allowed us to reconstruct four high- resolution atomic structures of the ribosome in four different consecutive steps of this mechanism (pre-accommodation, accommodation, translocation and post-translocation). In this way, we were able to highlight the molecular interactions at the atomic level that are essential to the whole process and are of particular interest since they can be used as targets against which new molecules with antibacterial activity can be developed.In the second part of the work we focused our attention on the structural characterisation of a third component involved in trans-translation, known as RNase R. The RNase R is an ribonuclease essential for the degradation of non-stop mRNA. It has been observed to compete for the same binding site on the ribosome with tmRNA, and to be highly dynamic when interacting with the ribosome itself. For this reason, the study was extended to a more complex system in which we sought to understand the exact role of all three players (tmRNA, SmpB and RNase R) during the stalling of two ribosomes on the same defective mRNA. This study is still ongoing. In the last chapter, we described a particular new conformation for one of the most important proteins of the ribosome, known as bS1. This protein is essential in the early stages of translation. In this case, one of its six domains, normally known to be involved in the interaction with the ribosome, shows a particular conformation that allows it to interact with the Shine-Dalgarno portion of the mRNA, stabilising its binding to its counterpart at the 3' end of the 16S rRNA. This observation may open the door to a better understanding of the mechanism of action of this protein.