Etude des multiples rôles des phosphatidylinositol-4-kinases betas dans la morphogenèse et les réponses de défense d'Arabidopsis thaliana

The multifaceted role of phosphatidylinositol-4-kinases beta in morphogenesis and defence responses of Arabidopsis thaliana

• Auteur / Autrice : Anastasiia Starodubtseva
• Direction : Eric Ruelland, Lenka Burketova
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de l'Univers et Environnement
• Date : Soutenance le 04/11/2022
• Etablissement(s) : Paris Est en cotutelle avec Technical University of chemistry and technology (Prague)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences, Ingénierie et Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut d’écologie et des sciences de l’environnement de Paris (1997-....) - Institut d'écologie et des sciences de l'environnement de Paris / iEES Paris
• Jury : Président / Présidente : Olga Valentova
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Eric Ruelland, Jan Martinec, Anne Guivarc'h, Marek Petřivalský
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jan Martinec, Anne Guivarc'h

Mots clés

Mots clés contrôlés

Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thaliana

Phospho-inositides

Mots clés libres

Immunité des plantes

Signalisation lipidique

Trafic vésiculaire

Plant immunity

Lipid signaling

Vesicular trafficking

Résumé

Les phosphatidylinositol 4-kinases (PI4K) sont les premières enzymes qui engagent le phosphatidylinositol dans la voie des phosphoinositides. Dans le génome d'Arabidopsis thaliana, douze isoformes putatives de PI4K ont été identifiées. Huit appartiennent au type II (AtPI4Kγ1-8) et quatre appartiennent au type III (AtPI4Kα1 et α2 et AtPI4Kβ1 et β2).Pour étudier le rôle des PI4K, j'ai travaillé avec une plante double mutante défectueuse dans les deux gènes PI4Kβ. J’ai montré que le double mutant d'Arabidopsis thaliana pi4kβ1β2 présente plusieurs phénotypes racinaires: une croissance racinaire altérée, une moindre sensibilité des racines à l'IAA exogène (acide indole-3-acétique), une gravistimulation altérée et une croissance des poils. Ces changements semblaient coïncider avec un cytosquelette d'actine moins stable et une altération de la dynamique du trafic intracellulaire dans les racines pi4kβ1β2. La teneur en auxine bioactive dans les racines pi4kβ1β2 était similaire à celle des racines de type sauvage. Ces données relient donc l'activité PI4K altérée à la modification du trafic vésiculaire et de l'organisation des filaments d'actine d'une part, et à la réponse altérée de l'auxine probablement due à l'altération de l'homéostasie de l'auxine d'autre part.La deuxième partie de ma thèse portait sur l'interaction de Blumeria graminis (Bgh) avec le double mutant pi4kβ1β2. On sait qu'Arabidopsis a une résistance non hôte à Bgh. Papilles - qui agit comme une barrière entre les champignons et les cellules végétales. Le double mutant pi4kβ1β2 a montré une meilleure pénétration de Bgh 24 hpi, donc une moindre résistance de la plante. La mutation sid2 touche le gène ISOCHORISMATE SYNTHASE 1nécessaire à la synthèse d’acide salicylique (SA). Un défaut similaire de résistance à la pénétration a été observé dans sid2/pi4kβ1β2, indiquant le caractère indépendant de SA de ce phénomène. La carence en PI4Kbetas a entraîné une diminution de l'accumulation du niveau de PI4P dans les papilles. Au cours de l'attaque pathogène, il a été démontré que de nombreux phospholipides et protéines s'accumulent dans les papilles. Mon hypothèse était que les PI4K sont essentielles pour une défense réussie des plantes contre la Bgh, et plus spécifiquement pour la formation d'une papille efficace.La troisième partie de ma thèse concerne le mécanisme conduisant à une immunité constitutivement active chez le double mutant pi4kβ1β2. Chez les plantes pi4kβ1β2 âgées de 4 semaines, une accumulation de SA. Cette accumulation de SA s'est avérée responsable de la stature naine des plantes pi4kβ1β2 âgées de 4 semaines. La question est donc de comprendre pourquoi le système immunitaire est constitutivement enclenché. Le système immunitaire pourrait être activé par l'intermédiaire de récepteurs localisés dans la membrane cellulaire ou solubles. Pour étudier le rôle des PI4K de type β dans la régulation des mécanismes de défense, j'ai d'abord croisé le double mutant pi4kβ1β2 avec plusieurs mutants affectés dans différents récepteurs ou régulateurs de l'immunité. Comme témoin, j'ai utilisé le triple mutant sid2/pi4kβ1β2 qui n'accumule pas de SA, contrairement aux plantes pi4kβ1β2. Pour le phénotype décrivant la taille de la rosette a été mesurée. Après cela, les caractéristiques typiques de l'immunité ont été testées : niveau de résistance à l'hémibiotrophe Pseudomonas syringae pv tomato DC3000, expression de PR1 et niveau d'accumulation de callose. Si l'un de ces récepteurs/régulateurs est en amont de l'accumulation de SA, j'espérais obtenir un phénotype végétal inversé avec des caractéristiques de type sauvage. Le phénotype nain pi4kβ1β2 a été préservé pour tous les mutants sauf un - wrky70/pi4kβ1β2_ ce qui indique un rôle possible du facteur de transcription WRKY70 dans l'accumulation constitutive de SA.

Phosphatidylinositol 4-kinases (PI4Ks) are the first enzymes that commit phosphatidylinositol into the phosphoinositide pathway. Phosphoinositides (PPI), minor components of plasma membrane, are the phosphorylated derivatives of phosphatidylinositol (PI), such as phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) and phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2). In the Arabidopsis thaliana genome, twelve putative PI4K isoforms have been identified. Eight belong to type-II (AtPI4Kγ1-8), and four belong to type-III (AtPI4Kα1 and α2 and AtPI4Kβ1 and β2).To study the role of PI4Ks, I have worked with a double mutant defective plant in both the PI4Kβ genes. I show that the Arabidopsis thaliana pi4kβ1β2 double mutant exhibits several root phenotypes: impaired root growth, a lower sensitivity of roots to exogenous IAA (indole-3-acetic acid), impaired gravistimulation, and misshapen root hair growth. These changes appeared to coincide with a less stable actin cytoskeleton and an alteration in intracellular trafficking dynamics in pi4kβ1β2 roots. The content of bioactive auxin in the pi4kβ1β2 roots was similar to that in wild-type ones. Yet, an enhanced auxin-conjugating activity was detected and the auxin level reporter DII-VENUS did not respond to exogenous auxin in pi4kβ1β2 mutant. These data, therefore, link altered PI4K activity to the modification of vesicular trafficking and actin filaments organization one the one hand to altered auxin response likely due to alteration in auxin homeostasis one the other hand.The second part of my thesis was related to the Blumeria graminis (Bgh) interaction with pi4kβ1β2 double mutant. It is known that Arabidopsis has non-host resistance to Bgh. It means that plants build a special resistance structure - papillae - that acts as a barrier between fungi and plant cells. The pi4kβ1β2 double mutant showed an enhanced successful penetration of Bgh 24 hpi. The sid2 mutation affects the ISOCHORISMATE SYNTHASE 1 gene necessary for the synthesis of salicylic acid (SA). A similar defect in penetration resistance was seen in sid2/pi4kβ1β2, indicating the SA-independent character of this phenomenon. Deficiency of PI4Kbetas led to decreased accumulation of PI4P level in papillae. During pathogen attack, plenty of phospholipids and proteins were shown to accumulate in papillae. My hypothesis was that PI4Ks are essential for plant successful defense against Bgh, and more specifically for the formation of a successful papilla.The third part of my thesis concerns the mechanism leading to a constitutively active immunity in pi4kβ1β2 double mutant. In 4-week-old pi4kβ1β2 plants, an accumulation SA occurs. This SA accumulation was shown to be responsible for the dwarf stature of 4-week-old pi4kβ1β2 plants. The question is therefore to understand why the immunity system is constitutively switched on. The immunity system could be activated through cell-membrane or nuclear localized receptors. To study the role of type β PI4Ks in the regulation of defense mechanisms, I first crossed the pi4kβ1β2 double mutant with several mutants affected in different receptors or regulators of immunity. The use of different types of receptors or regulators of immunity will cover a wide range of pathways associated with the both - cell-surface and intracellular immunity. As a control, I used the sid2/pi4kβ1β2 triple mutant that does not accumulate SA, in contrast to pi4kβ1β2 plants. For phenotype describing rosette size was measured. After that typical immunity features were tested: resistance level to hemibiotroph Pseudomonas syringae pv tomato DC3000, PR1 expression and callose accumulation level. If any of these receptors/regulators is upstream to SA accumulation, I hoped to obtain a reverted plant phenotype with wild-type features. The dwarf pi4kβ1β2 phenotype was preserved for all mutants except one - wrky70/pi4kβ1β2, which indicates a possible role of WRKY70 factor in the constitutive SA accumulation.