Kits LEctPROFILE : vers un contrôle de qualité et de nouvelles applications potentielles

LEctPROFILE kits : towards quality control and new potential applications

• Auteur / Autrice : Vittoria Federica Vena
• Direction : Ludovic Landemarre
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie - Biochimie
• Date : Soutenance le 13/12/2022
• Etablissement(s) : Orléans
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de chimie organique et analytique (Orléans ; 2012-....)
• Jury : Président / Présidente : Chrystel Lopin-Bon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Chrystel Lopin-Bon, Annabelle Varrot, Ján Tkáč, Julie Bouckaert
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Annabelle Varrot, Ján Tkáč

Mots clés

Mots clés contrôlés

Expériences

Glycosylation

Diagnostic biologique

Innovation

Glycanes

Criblage pharmacologique

Qualité

Glycoprotéines

Biochimie

Mots clés libres

Lectines

Lectin array

Biothérapies

Glycobiologie

Antigène Galili

Acide sialique

Néoglycoprotéines

Lectins

Lectin array

Biotherapeutics

Glycobiology

Galili antigen

Sialic acid

Neoglycoproteins

Résumé

La glycosylation affecte les propriétés des molécules biothérapeutiques, des médicaments fabriqués dans des systèmes vivants comme les cellules de mammifères, les bactéries ou les levures. La sialylation dans les produits biothérapeutiques peut affecter la demi-vie sérique et accélérer son élimination de l'organisme et peut également modifier les fonctions effectrices des anticorps monoclonaux. La glycosylation des produits biothérapeutiques dépend strictement du système d'expression et du processus de production : l'utilisation d'un système d'expression hôte mammifère non humain est très pratique car elle donne aux médicaments un schéma de glycosylation proche de celui de l'homme, mais elle a ses inconvénients. Les cellules CHO n'expriment que des acides sialyques liés par une liaison α2-3 et les cellules murines peuvent ajouter des épitopes glycanniques immunogènes tel que l'antigène Galili et également du Neu5Gc. Les principales techniques utilisées pour l'analyse des glycanes dans la production industrielle, comme la MS et l'HPLC, sont très précises, mais elles peuvent prendre du temps et exiger un haut niveau d'expertise. L'idée principale a été ici de développer un outil complémentaire, basé sur la technologie GLYcoPROFILE®, qui facilite au fabricant industriel le contrôle de la qualité d'une glycoprotéine recombinante thérapeutique au stade le plus précoce possible de la recherche, puis à chaque étape du développement et de la production pour établir un schéma de contrôle des glycosylations tout au long du développement, mais également de la production du futur biomédicament. Parmi les principales caractéristiques des kits LEctPROFILE, il y a la haute spécificité pour les glycanes d'intérêt : c'est un outil qui aide à discriminer les liaisons d'acide sialique et à distinguer les glycanes indésirables tels les motifs Galili et Neu5Gc. Ceci a été rendu possible grâce à la purification des lectines avec une haute sélectivité pour la partie du glycanne cible. En outre, le test doit être rapide, à haut débit et doit permettre à des chercheurs non spécialisés de réaliser l'analyse. Afin de développer ce type de test, nous avons synthétisé des néoglycoprotéines qui fonctionnent comme des sondes spécifiques pour l'étude des performances des kits. Nous avons établi un protocole de production par lots des cinq principales néoglycoprotéines d'intérêt, et nous avons démontré leur pureté, leur activité et leur spécificité vis-à-vis des lectines cibles. Ces molécules standard permettent d'établir des références relatives à la sélectivité des lectines, la limite de détection des kits et l' IC50 de différentes molécules de référence. Au cours de la thèse, l'idée d'application des kits s'est élargie : le même principe d'un screening rapide et facile à utiliser peut être appliqué à d'autres domaines. Par exemple, l'antigène Galili est un obstacle à la transplantation d'organes de porc chez l'homme. À ce jour, il n'existe pas de dépistage rapide et à haut débit capable de détecter la présence de l'antigène Galili sur les tissus et les organes transplantés. Cette lacune peut être comblée en construisant un réseau de lectines afin de détecter cet antigène sur les produits biothérapeutiques et les échantillons biologiques. L'altération de la sialylation peut conduire à des états pathologiques et elle est bien connue comme une caractéristique du cancer. De plus, le changement du rapport α2-3/α2-6 est impliqué dans le tropisme des agents pathogènes. Un taux important de l'acide sialique Neu5Gc associé à la présence d'anticorps anti-Neu5Gc est également décrit pour certains types de cancer, y compris les carcinomes du côlon, les rétinoblastomes, les cancers du sein et les mélanomes. Les kits LEctPROFILE axés sur l'acide sialique peuvent permettre une discrimination entre les deux liaisons ou entre Neu5Ac et Neu5Gc afin de fournir une semi-quantification et de disposer d'un outil rapide pour la découverte de biomarqueurs potentiels.

Glycosylation is one of the most important post-translational modifications of proteins: it affects folding, stability, molecular recognition and functionality. It also influences the properties of biotherapeutics, medicinal products manufactured in living systems like mammalian cells, bacteria, yeast. It was shown that lack of sialylation in biotherapeutics can affect the serum half-life of erythropoietin and accelerate its clearance from the body. It can also modify the monoclonal antibodies effector functions. The presence of sugar moieties like Galα1-3Gal (Galili antigen) and glycolyl neuraminic acid (Neu5Gc), can make a medicine unsafe, triggering an immune response from the human's body. Biotherapeutics glycosylation strictly depends on the expression system and on the manufacturing process: the use of non-human mammalian host expression system like Chinese hamster ovary cells and murine myeloma cells is very convenient because it gives the drugs a human-like glycosylation pattern, but it has its downsides. CHO only sialylate in the α2-3 linkage affecting the functionality of the biotherapeutic molecules and murine cells can add the immunogenic epitopes Galili antigen and Neu5Gc. When it comes to glycan analysis in industrial production, the main used techniques like mass spectrometry and HPLC are very accurate but they can be time-consuming and require a high-level of knowledge and expertise. The main idea has been to develop a tool that makes easy to the industrial manufacturer the quality control of their biotherapeutics at the earliest possible stage of research, then each stage of the development and production: a lectin array based on the GLYcoDiag's GLYcoPROFILE® technology. Among the main features of the LEctPROFILE kits there is the high-specificity for the glycans of interest: it is a tool that helps to discriminate the sialic acid linkages and to distinguish the unwanted glycans Galili and Neu5Gc. This is achieved thanks to the purification of lectins with high-selectivity for the target glycan moiety. In addition, it has to be fast, high-throughput and it has to allow non-specialized researchers to be able to perform the analysis. In order to develop this kind of assay, we have synthetised neoglycoproteins that work as specific probes for the study of the kits performances. To do so we have established a protocol for batch production of five main neoglycoproteins of interest, and we have demonstrated their purity, activity and specificity towards the target lectins. They allow to understand the lectins selectivity, the detection limit of the kits and the IC50 of different reference molecules. During the course of the thesis, the idea of application of the kits has broadened: the same principle of a fast and easy-to use screening can be applied to other fields than the quality control of biotherapeutics. For example the Galili antigen is an obstacle for the transplantation of organs from pig into humans. To date, there is no a fast, high-throughput screening able to detect their presence on transplanted tissues and organs. This gap can be addressed by building a lectin array in order to detect this antigen on biotherapeutics and biological samples. Another example is the alteration of sialylation that could lead to pathological states and it is well-known as a hallmark of cancer. Moreover, the changing of the ratio α2-3/α2-6 linkage is involved in pathogens tropism and It is also described that certain types of cancer, including colon carcinomas, retinoblastomas, breast cancers, and melanomas, show an increase of Neu5Gc and Neu5Gc antibodies. The LEctPROFILE kits focused on sialic acid can give a discrimination between the two linkages or between Neu5Ac and Neu5Gc in order to provide a semi-quantification and have a rapid tool for potential biomarker discovery.