Développement d'une plateforme pour le phénotypage à haut-débit des cellules souches cancéreuses par intelligence artificielle

par Alexis Chambost

Thèse de doctorat en Intelligence artificielle

Sous la direction de David Meyronet et de Sylvain Monnier.

Soutenue le 29-06-2022

à Lyon , dans le cadre de École Doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon) , en partenariat avec Université Claude Bernard (Lyon) (établissement opérateur d'inscription) et de Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon (laboratoire) .

Le président du jury était Laurent Schaeffer.

Le jury était composé de David Meyronet, Sylvain Monnier, Dominique Bagnard, Stéphanie Descroix, Annabelle Ballesta.

Les rapporteurs étaient Dominique Bagnard, Stéphanie Descroix.

mots clés

• Intelligence artificielle
• Cellules souches cancéreuses
• Microfluidique
• Intelligence artificielle en biologie -- Innovation
• Glioblastome
• Cellules souches
• Phénotype

Résumé

Le glioblastome (GBM) est la tumeur du système nerveux central la plus fréquente chez l'adulte. Malgré les moyens thérapeutiques disponibles de nos jours, le pronostic des patient.e.s atteint.e.s de ce cancer reste très sombre en raison des rechutes quasi-systématiques. Le modèle des cellules souches cancéreuses (CSC) permet d’expliquer l’origine de ces rechutes. Les CSC sont des cellules cancéreuses qui possèdent les propriétés essentielles d’une cellule souche : l’auto-renouvellement et la multi-potence. Or, il a été montré que les cellules souches de GBM (CSG) existent et qu’elles sont capables d’initier la croissance tumorale. Néanmoins, l’étude des CSG est complexe car il existe une très grande hétérogénéité au sein des CSG. Il existe une hétérogénéité clonale, c’est-à-dire que différentes sous-populations de CSG coexistent au sein de la tumeur mais expriment des marqueurs différents. D’autre part, l’hétérogénéité est également hiérarchique, c’est-à-dire qu’il existe moins une dichotomie franche entre les CSG et les cellules cancéreuses différenciées, qu’un continuum entre ces deux extrêmes, qui passe par des stades progéniteurs. Enfin, les CSG sont capables de plasticité. Non seulement les CSG peuvent passer d’une sous-population à l’autre en modifiant l’expression de leurs marqueurs, mais des cellules avancées dans la différenciation peuvent également réacquérir les propriétés souches. Cette complexité explique notamment pourquoi aucun marqueur moléculaire spécifique des CSG n’a encore été découvert. Pour notre étude, nous avons développé une plateforme pour étudier les CSG non pas en les identifiant moléculairement, mais en les caractérisant fonctionnellement. En effet, le statu « souche » d’une cellule dépend de ses capacités fonctionnelles d’auto-renouvellement et de multi-potence. Or il existe un test fonctionnel des propriétés souches et qui est facilement réalisable : le test de formation de neurosphère (NS). Une NS est un agrégat de cellules provenant d’un clone unique de CSG. Ce test permet donc d’identifier a posteriori les CSG. Cependant, le test de formation de NS n’est pas standardisé : il n’existe par exemple pas de seuil de taille pour définir une NS. D’autre part, l’homogénéité clonale des NS n’est souvent pas contrôlée. En effet, les cellules sont généralement cultivées en flasque et ces conditions ne permettent pas de contrôler l’agrégation des cellules entre elles. Il est donc impossible de savoir si un agrégat est bien un NS ou bien un agglomérat de cellules clonalement hétérogènes. Pour pallier ces écueils, nous avons développé une plateforme permettant 1) de s’assurer de l’homogénéité clonale des NS, 2) dans des conditions standardisées et reproductibles, 3) à haut-débit et 4) avec une analyse automatique utilisant des algorithmes d’intelligence artificielle. Nous avons conçu une puce de micro-fluidique composée de plusieurs centaines de micro-puits. Cette puce est constituée d’agarose, elle est donc bio-compatible, adaptée aux systèmes de culture cellulaire classiques et à la microscopie. Les cellules sont isolées dans les micro-puits et conservées en culture pendant plusieurs semaines pour que les NS soient formées. Ainsi, la capacité des cellules à former une NS est évaluée à la fin de l’expérience. Nous avons également étudié la probabilité des cellules à former une NS selon leur phénotype précoce. En réalisant de la vidéo-microscopie sur plusieurs jours après isolement des cellules, nous analysons le phénotype précoce de celles-ci (division, mort ou aucun de ces deux évènements). La corrélation du phénotype précoce et la formation de NS nous permet de réduire l’hétérogénéité au sein des sous-populations de CSG. Enfin, pour toutes ces analyses, nous avons annoté une base de plus de 17000 images afin d’entraîner des réseaux de neurones convolutifs. Nous sommes donc parvenus à développer une plateforme permettant le phénotypage à haut-débit et automatisé des CSC

mots clés

• Artificial intelligence
• Cancer stem cells
• Microfluidics

Titre traduit

Development of artificial intelligence-based high-troughput platform for cancer stem cell phenotyping

Résumé

Glioblastoma (GBM) is the most frequent tumour in adult central nervous system. Despite currently available therapies, prognosis of patients suffering from this cancer remains very poor, notably because relapses are quasi-systematic. The cancer stem cell (CSC) model can explain this high relapse rate. CSCs are cancer cells that have two properties that define stemness: self-renewal and multi-potency. GBM stem-like cells (GSCs) have been shown to be able of tumour initiation. However, studying GSCs have been a tough task because they are very heterogeneous. More precisely, there is a clonal heterogeneity between GSC sub-populations that share stemness properties but their expressed markers are different. In addition to that, GSCs are hierarchically heterogeneous because the difference between GSCs and differentiated cancer cells is less binary rather than continuous between these two states with progenitor intermediary states. Finally, GSCs are plastics, not only between sub-populations (GSCs can gain or lose expression of markers), but also along differentiation axis (a differentiated cancer cell can dedifferentiate and acquire stemness properties). Such complexity explains why there is still no reliable molecular marker for GSC identification. For our study, we have developed a platform in order to detect GSCs, but instead of relying on molecular markers, we functionally detected them based on their stemness properties: self-renewal and multi-potency. Precisely, the neursophere (NS) formation test is an easy way to functionally test those properties. A NS is a tridimensional aggregate of cells originating from a single clone. Hence, NS formation test allows to detect a posteriori GSCs. However, this test lacks of standardization: there is no size threshold defining a NS. Besides, NS clonal homogeneity is not always ensured because NS formation test is often performed in culture dish and such culture condition cannot prevent cell to cluster together, so it is impossible at the end to know if aggregates are real NSs or patchworks of different clones. In order to cop these pitfalls, we have developed a platform 1) which ensures clonal homogeneity of NSs, 2) in standardized and reproducible conditions, 3) at high throughput rate and 4) with automated artificial intelligence-based image analysis. We have designed a micro-fabricated device composed of hundreds of micro-wells. This chip is agarose-based so it is bio-compatible, suitable for cell culture and microscopy-friendly. Cells are isolated in micro-wells where they are kept in culture for weeks so they can grow as NS. Hence, stemness properties are assessed at end of experiment. We have also studied predictability of NS formation based on early phenotype. To do so, we time-lapse imaged cells for days after they were isolated in micro-wells and we analysed their early phenotype (division, cell death or neither of them). Then correlation between this early phenotype and NS formation allows us to decrease heterogeneity among GSC sub-populations. Finally, in order to perform all these analyses, we have annotated an image database of circa 17.000 images, and trained convolutional neuron networks. To conclude, we have been able to develop an automated high throughput phenotyping platform for CSC identification