Couplage de la photodissociation laser et la spectrométrie de masse pour la caractérisation de l’oxydation des cystéines protéiques

Protein cystein oxydation characterization by coupling mass spectrometry with laser induced dissociation

• Auteur / Autrice : Jean-Valery Guillaubez
• Direction : Marion Girod
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences analytiques
• Date : Soutenance le 09/05/2022
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Chimie (Lyon ; 2004-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Sciences Analytiques
• Jury : Président / Présidente : Jean-Yves Salpin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marion Girod, Christophe Hirtz, Joëlle Vinh, Isabelle Compagnon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christophe Hirtz, Joëlle Vinh

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéomique

Oxydation

Cystéine

Recherche

Marqueurs biologiques

Méthodologie

Analyse quantitative (chimie)

Mots clés libres

Spectrométrie de masse haute résolution

Photodissociation

Chromophore

Protéomique

Oxydation des cystéines

Alzheimer

COVID-19

High resolution mass spectrometry

Laser induced dissociation

Chromophore derivatization

Proteomics

Alzheimer

COVID-19

Cysteine oxydation

Résumé

Dans un contexte de population vieillissante, la découverte de nouveaux biomarqueurs de pathologies lourdes telles que les maladies neurodégénératives est un des enjeux clefs de notre ère. Grâce aux progrès technologiques, la recherche de biomarqueur se tourne vers des phénomènes minoritaires et transitoires jusque-là impossibles à quantifier. Les variations de l’oxydation des fonctions thiols des cystéines en acide sulfénique (Cys-SOH) ou leur suroxydation traduit la présence d’un dérèglement de l’équilibre redox du corps humain, le stress oxydant Cependant, de par l’importante gamme de concentration dynamique des échantillons biologiques, la quantification de ces Cys-SOH très peu concentrés représente un défi analytique. La plupart des méthodes de détection et de quantification des Cys-SOH emploient la spectrométrie de masse qui permet une localisation des sites d’oxydation grâce à la fragmentation des peptides issus des protéines oxydées. Cependant, ces techniques nécessitent généralement des étapes d’enrichissement/fractionnement des échantillons afin d’obtenir la sensibilité requise. Cette thèse porte sur l’amélioration de la sensibilité analytique pour la quantification des Cys-SOH endogènes d’échantillons biologiques en substituant la dissociation classique par collision (HCD) par la photodissociation induite par laser (LID) afin d’ajouter une spécificité optique à la spectrométrie de masse. En effet, le mode de fragmentation HCD est non-discriminant et l’intégralité des ions isobares est fragmentée, générant des interférences responsables du bruit analytique. Les peptides n’absorbant pas dans le visible, le greffage spécifique des Cys-SOH avec un chromophore absorbant à 473 nm, le dabcyl cyclohexanedione (DabDn), permet de cibler et fragmenter spécifiquement les peptides à Cys-SOH. La fragmentation laser du chromophore DabDn, synthétisé par le laboratoire de Chimie de l’ENS Lyon, a tout d’abord été étudiée et plusieurs mécanismes de fragmentation ont été proposés. La dérivation des Cys-SOH de peptides et protéines modèles dont les cystéines ont été oxydées in vitro a été optimisée et leur fragmentation étudiée. Il a également été démontré que la LID permet d’atteindre des limites de détection et de quantification plus basses que celles obtenues en HCD, grâce à la réduction du bruit interférent. La détection et la quantification des Cys-SOH endogènes de protéines plasmatiques par LID, via leur dérivation, de six échantillons de plasma humain ont été réalisées avec succès, permettant une quantification relative entre les échantillons. Cette méthode a ensuite été optimisée et appliquée pour le dosage multiplexé de protéines à Cys-SOH endogènes au sein d’une cohorte de plasma de patients sains, atteints de la maladie d’Alzheimer et positifs au COVID-19. Afin de pallier les biais dus à la variation instrumentale ou de la quantité de protéines entre individus, une stratégie de normalisation interne a été mise en place. Ainsi, les peptides à cystéine non oxydée, i.e. thiols libres (Cys-SH), ont été suivis après dérivation par un chromophore dabcyl maléimide, permettant lui aussi une fragmentation spécifique par LID. Le rapport des aires des pics peptides à Cys-SOH et Cys-SH dérivés par les deux chromophores fournit un ratio d’oxydation qui permet de comparer les différents niveaux d’oxydation des protéines plasmatiques suivies. Parmi les 54 plasmas analysés, des variations du taux d’oxydation des échantillons issus de patients positifs au COVID-19 par rapport au reste de la cohorte ont été observées pour cinq peptides issus de quatre protéines plasmatiques. La méthode développée permet donc une quantification relative des Cys-SOH endogènes directe, sensible, robuste, non-biaisée avec un protocole simple exempt d’étapes d’enrichissement ou de fractionnement.

In a context of population ageing, discovery of novel biomarkers for neurodegenerative diseases is a key issue. Thanks to technological improvements, research now focuses on difficult to quantify low abundance and transitory phenomenon. As an example, overabundance or overoxidation of cysteine thiols oxidized into sulfenic acids (Cys-SOH) reflects disorders of human body redox balance: oxidative stress. However, due to the complexity and concentration dynamic range of the biological samples, quantification of such low concentrated Cys-SOH remains an analytical challenge. Most detection and quantification methods use mass spectrometry, a tool that allows to localise oxidation sites by fragmentation of oxidized protein peptides. However, such techniques rely on enrichment/fractionation steps to reach the required sensitivity. The aim of this PhD work was to improve sensitivity for endogenous Cys-SOH quantification in biological samples by substituting the classical collision induced dissociation (HCD) mode by laser-induced dissociation (LID) at 473 nm in order to add an optical specificity to the mass selectivity. Indeed, HCD is a non-selective fragmentation mode, where all isobar ions are fragmented generating interferences analytical noise. Since peptides do not absorb in the visible range, this novel approach relies on the proper chemical derivatization of oxidized Cys with a chromophore absorbing at 473 nm, the dabcyl cyclohexanedione (DabDn), allowing to specifically target and fragment Cys-SOH peptides. The fragmentation of this chromophore, synthetized by the Laboratoire de Chimie of ENS Lyon, was first studied. Derivatization of model Cys-SOH peptides and proteins, whose cysteines were oxidized in vitro, was optimised and their fragmentation studied. LID allows to reach lower detection and quantification limits than HCD, by reducing interfering noise. Derivatized endogenous plasma proteins Cys-SOH from six plasma sample were successfully detected and quantified, allowing to perform relative quantification between samples. This methodology was then optimized and applied for multiplexed quantification of endogenous Cys-SOH proteins of a cohort of plasma samples from healthy, with Alzheimer’s disease and COVID-19 positives patients. Internal normalisation was introduced to mitigate instrumental and total protein content in-between samples bias. Non-oxidized cysteine peptides were monitored after derivatization with a dabcyl maleimide chromophore allowing specific LID fragmentation. Derivatized Cys-SOH and Cys-SH peaks area ratio provides an oxidative ratio allowing to compare plasma protein oxidative levels. Oxidative status variations from 54 plasmas were detected for five peptides in COVID-19 positive patient samples. This method allows a direct, sensitive, unbiased, robust quantification of endogenous Cys-SOH that does not require enrichment or fractionation steps.