Caractérisation du métabolisme de Eubacterium limosum par une approche quantitative de biologie des systèmes

Characterization of the metabolism of Eubacterium limosum by a Quantitative Systems Biology Approach

• Auteur / Autrice : Guillaume Pregnon
• Direction : Philippe Soucaille
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Soutenance le 14/09/2022
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering - Toulouse Biotechnology Institute / TBI
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Meynial
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Kaspar Valgepea, Benjamin Woolston, Peter Durre

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéomique

Biologie systémique

Mots clés libres

Eubacterium limosum

Biologie des systèmes

Caractérisation du métabolisme

Fluxomique

Protéomique

Transcriptomique

Eubacterium limosum

Systems biology

Metabolic characterization

Fluxomic

Proteomic

Transcriptomic

Résumé

Eubacterium limosum est une bactérie anaérobie stricte, faisant partie du groupe des acétogènes. Son intérêt réside dans sa capacité à transformer des sources de carbone à un atome de carbone (C1) telle que le méthanol en butyrate, composé en C4 présentant un intérêt industriel. Néanmoins, les rendements et productivité doivent être améliorés pour se rapprocher des performances de l’industrie chimique. L’ingénierie métabolique des souches permettrait d’atteindre cet objectif mais pour cela il est nécessaire d’améliorer nos connaissances du métabolisme central.L’objectif principal de ce projet de thèse était de caractériser le métabolisme central de E. limosum B2 cultivé en chemostat sur méthanol ou sur glucose comme source de carbone, par une approche de biologie des systèmes.Suivant un processus d’adaptation évolutive en laboratoire, la souche sauvage a été adaptée milieu synthétique méthanol sans extrait de levure. Le taux de croissance maximal chez le clone isolé a été amélioré par 2,72. De plus, nous sommes parvenus à substituer la cystéine du milieu synthétique, décrite comme indispensable, par du thiosulfate de sodium. La souche sauvage s’est montrée incapable de croître dans ces conditions, suggérant l’apparition de mutations favorable chez le mutant. Le génome de la souche sauvage a d’abord été séquencé de novo, suivi des génomes de la population sur plusieurs générations et de trois clones isolés pour étudier la dynamique d’évolution génétique. Aucune mutation pouvant expliquer ce changement de phénotype n’a a été détectée dans le métabolisme central. Une étude protéomique a été réalisée sur la souche sauvage et adaptée afin d’éclaircir les mécanismes d’adaptations. Parmi les protéines surproduites chez la souche adaptée, deux dans le WLP et deux en gluconéogenèse, ainsi qu’un complexe lié à l’assimilation du soufre ont été identifiés. De plus, l’exploration du méthylome a révélé un évènement de recombinaison homologue au niveau du système de restriction-modification de type I entre les deux souches. Cette modification pourrait jouer un rôle clé dans le mécanisme de régulation sur milieu minéral méthanol.La souche adaptée a été cultivée en chémostat pour la caractérisation de son métabolisme central sur méthanol ou sur glucose comme seule source de carbone. Les paramètres physiologiques ont été déterminés et les flux d’entrée et de production ont été calculés. Ces valeurs ont été intégrées dans un modèle in silico à l’échelle du génome pour estimer les flux spécifiques de chaque enzyme du métabolisme primaire. De ces estimations, des modèles de conversation de l’énergie ont été élaborés pour les deux conditions étudiées. Le nombre absolu de copies de protéines par cellule a ensuite été déterminé puis ces données ont permis d’estimer la constante catalytique in vivo de chaque enzyme du métabolisme central. Ce paramètre nous a été utile pour comparer les activités des enzymes et identifier les plus limitantes.Pour la partie transcriptomique, le développement d’une méthode d’extraction totale des ARNm a été un défi majeur. Nous avons élaboré une stratégie de quantification absolue des ARNm par cellule renforcée par l’ajout de deux mélanges de standards externes lors du procédé d’extraction des ARNm. Le premier a été ajouté après l’étape de lyse cellulaire et le second avant la ribodéplétion. Les résultats de séquençage par RNA-Seq ont été satisfaisant, avec une bonne corrélation entre le nombre de « reads » obtenus pour chaque standard et leur concentration théorique, indiquant une perte minimale en ARNm durant le processus d’extraction. La détermination de la quantité absolue de chaque transcrits est désormais possible.En combinant les données de protéomique et de transcriptomique, la vitesse spécifique de traduction in vivo de chaque protéine pourra être déterminée. Nos travaux permettront d’améliorer le modèle in silico d'E. limosum et permettre l’utilisation d’une approche rationnelle d’ingénierie métabolique.

Eubacterium limosum is a strict anaerobic bacterium, belonging to the group of acetogens. It’s interest lies in its ability to transform one carbon (C1) feedstock into butyrate, a C4 molecule, through the oldest metabolic pathway on earth, called the Wood-Ljungdahl Pathway (WLP).Nevertheless, yields and productivities must be improved to reach performances close to chemical processes. For this purpose, metabolic engineering strategies are needed but improving our knowledge on primary metabolism is of paramount importance to reach this goal.The work performed in this thesis project aimed to characterize, by a systems biology approach, the central metabolism of E. limosum B2 growing in chemostat cultures on methanol or on glucose as a carbon source.Following an adaptive laboratory evolution process, the wild strain was cultivated on synthetic methanol medium without yeast extract. The maximum growth rate for the evolved clone was improved by 2.72. In addition, we succeeded in substituting the cysteine of the synthetic medium, described as essential, with sodium thiosulfate. The wild type strain was unable to grow under these conditions, suggesting positive mutations in the evolved clone. The complete genome of the wild strain was first sequenced, de novo, followed by the genomes of the population on several generations and the isolated clone in order to identify and study the dynamics of genetic evolution. No mutation that could explain this change in phenotype was detected in the genes encoding enzymes of the primary metabolism. A proteomic study was carried out on the wild type and the adapted strain to clarify the adaptation mechanisms. Among overexpressed proteins measured in the adapted strain, four proteins involved in central metabolism, including two in the WLP and two in gluconeogenesis, as well as a protein complex linked to sulfur assimilation were identified. In addition, exploration of the methylome revealed a homologous recombination event on the type I restriction-modification system between the two strains. This event by changing the methylome of the evolved clone, could play a key role in the regulatory mechanism on synthetic methanol medium.The adapted strain was grown in chemostat cultures for the characterization of its central metabolism on methanol or glucose as a carbon source. The physiological parameters were4determined as well as all the input and output fluxes. These values were integrated into a in silico genome scale model to estimate the specific fluxes of each enzyme of primary metabolism. From these estimations, energy conversation models were developed for the two conditions studied. The absolute number of protein copies per cell was then determined and these data allowed the estimation of the in vivo turnover rates for each enzyme. This parameter was useful to compare enzyme activities and identify the most limiting ones.For the transcriptomic part, the development of a total mRNA extraction method was a major challenge. We developed a strategy for the absolute quantification of mRNA per cell reinforced by the addition of two mixes of external standards during the extraction process. The first was added after the cell lysis step and the second before ribodepletion. RNA-Seq sequencing showed satisfactory results with a good correlation between the number of reads obtained for each standard and their theoretical concentration, indicating a minimal loss of mRNA during the extraction process. The determination of the absolute mRNA content for each gene is now possible.By combining proteomics and transcriptomics data, the in vivo specific synthesis rate of each protein can be determined. Our work will improve the in silico model of E. limosum and allow the use of a rational metabolic engineering approach.