Etude moléculaire des étapes initiales d'importation de protéines mitochondriales

Atomic-level studies of the initial mitochondrial-protein import steps

• Auteur / Autrice : Iva Sucec
• Direction : Paul Schanda, Beate Bersch
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Structurale et Nanobiologie
• Date : Soutenance le 01/08/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Groupe de RMN biomoléculaire (Grenoble ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Franz Brückert
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Paul Schanda, Beate Bersch, Johannes Martin Herrmann, Karen Fleming
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nadia Izadi-Pruneyre, Sebastian Hiller

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mitochondries

Mitochondriopathies

Spectroscopie de la résonance magnétique nucléaire

Mots clés libres

Spectroscopie RMN

Dynamique et interactions des protéines

Récepteurs des protéines

Protein dynamics and interactions

Mitochondrial import system

Protein receptors

NMR spectroscopy

Résumé

Chez les eucaryotes, les mitochondries jouent un rôle important dans de nombreux processus cellulaires. 99 % des ~1500 protéines mitochondriales sont codées par le génome nucléaire et synthétisées dans le cytosol. Par conséquent, le bon fonctionnement des mitochondries dépend de l'importation, de la localisation et du repliement correct de ces protéines dites précurseurs/clientes. Le TOM complexe formant la translocase de la membrane externe (TOM) reconnaît spécifiquement les protéines précurseures via leurs signaux d’adressage et permet leur translocation à travers la membrane externe. En aval du complexe TOM, un seul système de chaperonnes de l'espace intermembranaire, les chaperonnes TIM, assurent le transport des protéines membranaires hautement hydrophobes à travers l'espace intermembranaire.Dans la première partie, je montre la caractérisation de la liaison de différentes protéines membranaires clientes à deux chaperonnes TIM, en cherchant à expliquer leur spécificité à un niveau atomique. Auparavant, en intégrant des expériences de RMN en solution avec différentes techniques biophysiques et biochimiques ainsi que la modélisation moléculaire, le site de liaison hydrophobe conservé sur la chaperonne TIM9.10 a été révélé. Le mode d'interaction "flou", où le client se lie dans un état déplié et translocation-compétent, échantillonnant une multitude de conformations, soutient le rôle apparemment contradictoire des chaperonnes TIM: protéger les clients membranaires hautement hydrophobes de l'agrégation par une liaison étroite, en autorisant simultanément leur transfert à l'insertase en aval sans barrière énergétique significative. Nous montrons ici qu'un petit groupe de clients de protéines membranaires possédant un domaine supplémentaire soluble, montre une préférence pour la chaperonne TIM8.13, non essentielle dans la levure. Pour ce type de client, la liaison n'est pas seulement médiée par les patches hydrophobes de la chaperonne, mais elle implique également un réseau d'interactions polaires sur un site de liaison distinct que seul TIM8.13 fournit. L'intégration des données RMN et SAXS avec des simulations de dynamique moléculaire nous fournit deux modèles de liaison chaperonne-client pour deux chaperonnes structurellement très similaires.Dans la deuxième partie, je présente les études d'interaction des domaines cytosoliques de trois récepteurs de la machinerie d'importation TOM. Les récepteurs Tom20, Tom22 et Tom70 reconnaissent spécifiquement les protéines précurseurs via les signaux d’adressage. En raison du chevauchement partiel des fonctions de ces récepteurs démontrées in vivo, le mécanisme de reconnaissance des clients ainsi que l'interaction entre les trois récepteurs reste à caractériser au niveau atomique. Nous avons utilisé la spectroscopie RMN en solution, ainsi que des techniques biochimiques et biophysiques pour étudier et caractériser (i) les domaines cytosoliques des récepteurs en absence de client, (ii) les complexes récepteur-protéine cliente, (iii) les interactions entre les récepteurs et (iv) les interactions entre les récepteurs Tom et une co-chaperonne cytosolique. Ces études constituent un défi en raison de la nature dynamique, flexible et, dans le cas de Tom70, relativement grande des domaines des récepteurs. Nos résultats révèlent un modèle d'interaction du domaine cytosolique intrinsèquement désordonné de Tom22 avec les deux autres récepteurs et avec la co-chaperonne cytosolique Xdj1. Ce modèle suggère un rôle universel de Tom22 qui implique le remplacement du client dans son site de liaison sur Tom20, Tom70 et Xdj1. Une telle interaction peut être nécessaire pour la libération de la protéine cliente et son transfert du récepteur Tom20 (ou Tom70 ou Xdj1) à travers le pore Tom40 de la membrane externe. Ensemble, les résultats obtenus fournissent des indications fonctionnelles sur les premières étapes de l'importation des protéines mitochondriales.

Mitochondria play an important role in numerous eukaryotic cellular processes with 99% of their ~1500 different proteins being encoded by the nuclear genome and synthesized in the cytosol. Consequently, the proper functioning of mitochondria depends on correct import, localization and folding of these so-called precursor/client proteins. The translocase of the outer membrane (TOM) complex specifically recognizes the precursor proteins via their targeting signals and enables their translocation through the outer membrane. Among the import machineries downstream from the TOM complex, a sole chaperoning system of the intermembrane space, TIM holdase chaperones, is ensuring aggregation-free transport of highly hydrophobic membrane proteins through the intermembrane space.In the first part I am showing the characterization of the membrane protein client binding on two TIM chaperones which explains the TIM’s chaperones substrate specificity on an atomic level. Previously, the conserved hydrophobic binding site on TIM9.10 chaperone has been revealed integrating solution NMR experiments with different biophysical and biochemical assays and molecular modeling. The “fuzzy” mode of interaction, where the client binds in an unfolded, translocation-competent state, sampling a multitude of conformations, supports apparent contradictory role of TIM chaperones: protecting highly hydrophobic membrane clients from the aggregation by tight binding, and also the transfer of the client to the downstream insertase without any significant energetic barrier. Here we show that a small pool of membrane protein clients with additional soluble domain shows preference in binding to the other, non-essential TIM8.13 chaperone. We showed that for this type of client, the binding is not only mediated by the hydrophobic patches on the chaperone, but that it additionally involves a network of polar interactions at a distinct binding site that only TIM8.13 provides. Integrating NMR, SAXS and molecular dynamic simulations provides us with two models of chaperone-client binding for two structurally very similar chaperones.In the second part I am showing the interaction studies of the three cytosolic receptor domains of the TOM import machinery. The Tom receptors, Tom20, Tom22 and Tom70, specifically recognize their clients, the precursor proteins, via the targeting signals of the client. Due to receptors partially overlapping function shown in vivo, the mechanism of client recognition and interaction between three different receptors on the atomic level remains to be characterized. We used solution NMR spectroscopy, biochemical and biophysical techniques to study and characterize: (i) the apo cytosolic domains of the Tom receptors, (ii) Tom receptor--client protein complexes, (iii) interactions between the individual Tom receptors and (iv) Tom receptor(s) interactions with the cytosolic co-chaperone Xdj1. These are challenging studies due to the dynamic, flexible - and in case of Tom70, relatively big - nature of the Tom receptor domains. Our results reveal an interaction pattern of cytosolic, intrinsically disordered domain of Tom22 with the other two receptors and the cytosolic co-chaperone, suggesting an universal role of Tom22 as a client replacement in the Tom20, Tom70 and Xdj1 client binding site. Such interaction may be required for the release of the client protein and its transfer from the Tom20 receptor (or Tom70 or Xdj1) through the outer membrane Tom40 pore. Together, obtained results are providing functional clues about the sequence of the events during the first steps of the mitochondrial protein import.