Identification de composés pharmacologiques augmentant le relâchement calcique dans les cellules musculaires - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2022

Identification of pharmacological compounds increasing calcium release in muscle cells

Identification de composés pharmacologiques augmentant le relâchement calcique dans les cellules musculaires

Lauriane Travard
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1194796
  • IdRef : 265288819

Résumé

Muscle contraction is a complex process with many steps. A stimulation from the motoneuron causes a depolarization of the plasma membrane of the muscle fiber. The depolarization reaches the triad, a structure composed of an invagination of plasma membrane (the T tubule) flanked by two sarcoplasmic reticulum terminal cisternae. It then activates a calcium channel situated in the T-tubune membrane, the dihydropyridine receptor (DHPR). In turn, DHPR activates the ryanodine receptor (RyR1), a second calcium channel to which it is mechanically coupled. RyR1 releases calcium from the reticulum to the cytosol, which leads to the shortening of the sarcomeres and thus muscle contraction. RYR1 mutations, of which there are many, cause alterations of RyR1 expression or function, which result in defects of calcium release that are the cause of RYR1-related myopathies (RYR1-RM). The main symptom of these pathologies is a defect of muscle strength of varying severity. There is currently no treatment, though several therapeutic approaches are being studied. Thus, we targeted calcium release alterations, which are found in a majority of patients regardless of the mutation.The goal of this thesis work was to identify small chemical molecules capable of restoring calcium release in muscle cells from RYR1-RM patients, regardless of the mutation.First, we studied the effect of fulvestrant, an extrogen inhibitor, on the calcium release of human and mouse muscle cells and on muscle strength in a RYR1-RM mosue model developed by our team. Fulvestrant delays the loss of muscle strength in male mice only and improves calcium release in mouse cells. However, it has no effect on human muscle cells.We then developed a screening method suitable for quickly testing many compounds. We screened a chemical library of 9,252 molecules on immortalized muscle cells from a RYR1-RM patient. Hits were validated on a second patient cell line with a different mutation, as well as on primary muscle cells from our mouse model of RYR1-RM. We selected two of the most promising molecules, 38D12 and 64E5, and characterized their mechanism of action. We showed that 38D12 seems to act upstream from the DHMR/RyR1 coupling, while 64E5 increases releasable calcium stores in the reticulum by increasing calcium recapture. We then studied the pharmacokinetic properties of the molecules. We are now aiming for preclinical validation of the molecules.
La contraction musculaire est un processus complexe qui comprend plusieurs étapes. Une stimulation provenant du motoneurone provoque d’abord une dépolarisation de la membrane plasmique de la fibre musculaire. Cette dépolarisation se propage jusqu’à la triade, une structure constituée d’une invagination de la membrane plasmique (le tubule T) flanquée de deux citernes terminales de réticulum sarcoplasmique. La dépolarisation active un canal calcique situé dans le tubule T, le récepteur des dihydropyridines (DHPR). Celui-ci active un second canal calcique situé dans la membrane du réticulum, auquel il est mécaniquement couplé, le récepteur de la ryanodine (RyR1). L’ouverture du canal RyR1 conduit à un relâchement de calcium du réticulum vers le cytosol à l’origine du glissement des filaments contractiles au niveau des sarcomères et donc la contraction musculaire. Les mutations de RYR1, qui sont très nombreuses, provoquent des altérations de l’expression ou de la fonction de RyR1 qui résultent en une diminution du relâchement calcique et causent des pathologies musculaires appelées « myopathies liées à RYR1 » (ou RYR1-related myopathies, RYR1-RM). Le principal symptôme est un défaut de force musculaire de sévérité variable. Il n’existe actuellement aucun traitement pour ces pathologies, bien que plusieurs approches thérapeutiques soient en cours d’investigation. C'est dans ce contexte que nous avons ciblé les altérations du relâchement calcique, que l'on retrouve chez une majorité de patients, quelle que soit la mutation.L’objectif de ce travail de thèse était d’identifier des petites molécules chimiques capables de restaurer le relâchement calcique dans des cellules musculaires issues de patients atteints de RYR1-RM, et ce peu importe la mutation.Dans un premier temps, nous avons étudié l’effet du fulvestrant, un inhibiteur de la voie estrogénique, sur le relâchement calcique de cellules musculaires humaines et murines et sur la force musculaire dans un modèle murin de RYR1-RM développé par notre équipe. Le fulvestrant retarde l’évolution de la perte de force chez les souris mâles uniquement et améliore le relâchement calcique dans les cellules murines. Cependant, il n’a aucun effet sur les cellules humaines.Dans un second temps, nous avons mis au point une méthode de criblage permettant de tester rapidement un grand nombre de molécules et criblé une chimiothèque de 9 252 molécules sur une lignée immortalisée de cellules musculaires d’un patient myopathe. Les hits ont été validés statistiquement, et plusieurs d’entre eux sont efficaces sur une lignée immortalisée issue d’un second patient myopathe porteur d’une mutation différente, ainsi que sur des cellules primaires issues de notre modèle murin de RYR1-RM. Nous avons finalement sélectionné deux des molécules les plus prometteuses, 38D12 et 64E5, et initié la caractérisation de leur mécanisme d’action. Nous avons mis en évidence que 38D12 agit a priori en amont du couplage DHPR/RyR1, alors que 64E5 augmente les stocks calciques libérables du réticulum sarcoplasmique par le biais de l’augmentation de la recapture du calcium. Nous avons ensuite étudié les propriétés pharmacocinétiques de ces molécules. Nous nous dirigeons à présent vers une démarche de validation pré-clinique des molécules.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03873597 , version 1 (27-11-2022)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03873597 , version 1

Citer

Lauriane Travard. Identification de composés pharmacologiques augmentant le relâchement calcique dans les cellules musculaires. Physiologie [q-bio.TO]. Université Grenoble Alpes [2020-..], 2022. Français. ⟨NNT : 2022GRALV051⟩. ⟨tel-03873597⟩

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