Destin et comportement des spores du groupe Bacillus cereus chez des organismes modèles

Fate and behavior of spores of Bacillus cereus group

• Auteur / Autrice : Salma Hachfi
• Direction : Armel Gallet, Laurent Boyer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie et Microbiologie
• Date : Soutenance le 16/03/2022
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Sophia Agrobiotech (Sophia Antipolis, Alpes-Maritimes)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Côte d’Azur (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Christine Coustau
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christine Coustau, Bruno Lemaitre, Philippe Gérard, Bernard Charroux
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bruno Lemaitre, Philippe Gérard

Mots clés

Mots clés contrôlés

Souris de laboratoire

Drosophila melanogaster

Réponse immunitaire

Spores

Bacillus thuringiensis

Bacillus cereus

Mots clés libres

Bacillus cereus

Bacillus thuriengiensis

Spores

Réponse immunitaire innée

Drosophila melanogaster

Souris

Bacillus cereus

Bacillus thuriengiensis

Spores

Innate immune response

Drosophila melanogaster

Mice

Résumé

Le groupe Bacillus cereus (B. cereus) regroupe des bactéries Gram positives issues de l’environnement. Ces bactéries sont capables de sporuler quand les conditions sont défavorables. Les membres de ce groupe peuvent être impliqués dans des intoxications alimentaires représentant ainsi la troisième cause d'intoxication alimentaire en Europe et la deuxième en France. L’espèce B. thuringiensis (Bt) appartient au groupe B. cereus et se caractérise par la production de cristaux parasporaux contenant des toxines Cry insecticides avec une forte spécificité d’action. Ainsi, les spores et les cristaux de Bt sont utilisés comme bioinsecticides pour lutter spécifiquement contre les larves de lépidoptères ravageurs. Les produits à base de Bt représentent plus de 50 % de marché mondiale des biopesticides. Une fois les spores et les cristaux ingérés par un organisme cible (les larves de lépidoptères), les toxines Cry contenues dans le cristal sont libérées et détruisent l'épithélium intestinal. Ensuite, le passage et la germination des spores dans l'hémolymphe entraînent une mort rapide du ravageur par septicémie. L’utilisation accrue de ces bioinsecticides Bt pose la problématique des risques potentiels engendrés sur les organismes non ciblés.En utilisant le modèle Drosophila melanogaster (un organisme non-cible de Bt), il avait été précédemment montré que les formes végétatives de Bt sont rapidement éliminées de l'intestin. Cette élimination est corrélée avec l'activation de la réponse immunitaire innée locale. Cependant, des études disparates suggéraient que les spores de Bt pouvaient persister dans les intestins des mammifères. Afin d’étudier le comportement de ces spores dans l'intestin des organismes non ciblés et l’implication de la réponse immunitaire innée, j’ai utilisé deux modèles de laboratoire : Drosophila melanogaster et la souris. En premier lieu, j'ai pu montrer qu’après une ingestion ponctuelle, les spores persistent jusqu'à 10 jours dans l'intestin moyen des drosophiles et au moins 5 jours dans l’intestin grêle des souris. Ce résultat m’a conduit à étudier le devenir de ces spores dans l’intestin. Pour cela, j'ai utilisé un outil généré au laboratoire où les spores fluorescent en rouge qui une fois germées en cellules végétatives acquièrent une fluorescence verte. En utilisant ces spores marquées, j'ai montré que ces dernières s'accumulent et germent préférentiellement dans les parties postérieures de l’intestin moyen de drosophile et de l’intestin grêle de souris. J’ai ensuite confirmé ces résultats qualitatifs par une approche quantitative en dénombrant spores et bactéries végétatives dans les différentes régions de l’intestin. Ainsi, toutes mes données suggèrent que la réponse immunitaire innée au niveau de la région postérieure de l’intestin moyen/grêle est inefficace pour éliminer rapidement les spores et les bactéries germées.Ensuite, je me suis donc focalisée sur la réponse immunitaire innée locale. Dans l'intestin moyen de la drosophile, cette réponse est localisée principalement dans les régions antérieures et se manifeste par une production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de peptides antimicrobiens (AMP). Mes résultats montrent que contrairement aux cellules végétatives, les spores n’induisent pas la production de ROS et d’AMP par l’épithélium intestinale. Etonnamment, j’ai même observé que la production d’AMP est réprimée. J’ai ensuite démontré que l’ingestion de spores induit l’expression de gènes codant pour des régulateurs négatifs (PGRP-SC1, -SC2 et -LB) de la réponse immunitaire innées dans la région postérieure de l’intestin moyen. Enfin, en utilisant des combinaisons de mutants des deux voies de signalisation immunitaires, Imd et Toll, j’ai pu caractériser pour la première fois leur coexistence dans l'intestin moyen de la drosophile et leur contribution de manière additive ou synergique aux infections par des spores du groupe B. cereus.

The Bacillus Cereus (B cereus) group consists of Gram-positive bacteria, commonly isolated from the environment. Members of the B. cereus group are spore-forming bacteria commonly associated with food poisoning and intestinal infections and represent the third cause of food poisoning in Europe and the second in France. The most-studied members of this group are B. anthracis, B. cereus sensu stricto (Bc), and B. thuringiensis (Bt) that are well known for their pathogenic activity. Bt is characterized by the production, during its sporulation, of a crystal containing insecticidal Cry toxins. Thanks to this entomopathogenic activity, bioinsecticides based on spores and crystals of Bt are used to specifically kill lepidopteran pests. Bt bioinsecticides represent more than 50% of the global market share of biopesticides. Upon ingestion of Bt bioinsecticides (spores and toxin crystals), Cry toxins are released from the crystal and destroy the insect gut epithelium allowing spores to invade the internal milieu. Then spores’ germination in the hemolymph lead to the pest death by septicemia in less than 3 days. However, the increasing environmental dispersion of Bt products raises the question about their potential risks for non-target animals.Using Drosophila melanogaster (a non-target organism), it has been previously shown that Bt vegetative cells are rapidly cleared from the intestine. This elimination is due to the activation of the local innate immune response. However, few studies suggest that Bt spores can persist in human and rodent intestines. To understand why and how Bt/Bc spores persist in the gut of non-target organisms and the implication of the innate immune response in fighting spores, I have used two powerful models: Drosophila melanogaster and mice. First, I have shown that Bt/Bc spores can persist, after acute ingestion, up to 10 days in the Drosophila midguts and at least 5 days in mice small intestines., Then, using an innovative tool, generated in my lab, consisting of red fluorescent spores that switch in green fluorescent once germinated (corresponding to vegetative bacteria), I have shown that spores accumulate mainly in the posterior midgut of Drosophila and the posterior small intestine of mice where they can further germinate. Then, I confirmed these data using quantitative monitoring of spores vs. vegetative bacteria accumulation in vivo in the intestines of Drosophila and mice. Altogether, my data suggest that, in the posterior regions of the Drosophila midgut (and the small intestine of mice), the innate immune response is inefficient to promptly eliminate spores and germinated bacteriaIn Drosophila midgut, the local innate immune response (i.e. the production of Reactive Oxygen Species (ROS) and Anti-Microbial Peptides (AMPs)) is mainly mounted in the anterior regions. I have shown that, unlike vegetative cells, spores do not trigger ROS and AMPs production. Strikingly, I have even observed that spores inhibit AMPs production. Interestingly, I have found a transcriptional induction of negative regulators (e.g. PGRP-SC1, -SC2, and -LB) of the immune signaling pathways in the posterior region of the midgut in response to spore ingestion. Then, using combinations of mutants of the two immune pathways, Imd and Toll, I have been the first to demonstrate that both immune pathways coexist in the Drosophila midgut, and may contribute either additively or synergistically to fight spore infections.