Etude des mécanismes moléculaires impliqués dans l'assemblage des systèmes d'efflux tripartites RND participant à la résistance aux antibiotiques chez Pseudomonas aeruginosa

Study of the molecular mechanisms involved in the assembly of RND tripartite efflux systems playing a part in antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa

• Auteur / Autrice : Esther Boyer
• Direction : Olivier Lambert
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 22/03/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (Bordeaux ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Véronique Dubois
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Lionel Mourey
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nienke Buddelmeijer, Laurent J. Catoire

Mots clés

Mots clés contrôlés

Pseudomonas aeruginosa

Microscopie électronique en transmission

Biophysique

Protéines membranaires

Résistance aux antibiotiques

Mots clés libres

Résistance aux antibiotiques

Protéines membranaires

Techniques biophysiques

Microscopie électronique à transmission

Antibiotic resistance

Membrane proteins

Biophysical techniques

Tem

Résumé

Face à la menace croissante de l’antibiorésistance, il est urgent de mieux connaître ses mécanismes afin de trouver des solutions pour combattre mais aussi limiter l’apparition des souches multirésistantes. Dans ce contexte, le sujet de la thèse vise à mieux comprendre les bases moléculaires de l’efflux actif de drogues chez Pseudomonas aeruginosa, l’un des plus importants mécanismes utilisés par la bactérie pour lutter contre l’action d’un grand nombre d’antibiotiques. Les systèmes d’efflux forment des complexes protéiques situés dans la paroi de la bactérie capables d’expulser de manière active une grande variété de composés, dont les antibiotiques, avant même qu’ils aient pu atteindre leur cible intracellulaire, les rendant ainsi inactifs.Chez les bactéries à Gram négatif, les systèmes d'efflux tripartites partagent une architecture structurelle similaire, composée d'un transporteur inséré dans la membrane interne et d'un canal traversant la membrane externe, pontés par une protéine adaptateur périplasmique. Les trois partenaires forment ainsi un conduit étanche traversant le périplasme, permettant d’expulser l’antibiotique à l’extérieur de la bactérie grâce à l'utilisation d’un gradient de proton.L’objectif de la thèse a été de développer des études structurales et biophysiques pour mieux comprendre le mécanisme d’assemblage du complexe tripartite MexA-MexB-OprM, prototypique des systèmes d’efflux tripartites de la famille des RND (Resistance Nodulation cell Division). La stratégie a consisté à analyser les interactions bipartites par des méthodes biophysiques (BioLayer Interferometry, Flow Induced Diffusion Analysis) et de déterminer la structure des complexes tripartites par microscopie électronique en coloration négative, en incluant des protéines tronquées ou comportant des mutations ponctuelles.Des déterminants structuraux pour l’adaptateur MexA ont été identifiés, permettant d’étendre son interaction à d’autres protéines canal qu’OprM. L’implication dans le mécanisme d’assemblage d’une mutation ponctuelle de MexA (Q93R), présente dans la couronne de six hélices décrite dans la structure cryo-ME du complexe tripartite et située proche d’OprM, a été analysée. Cette mutation n’est pas impliquée directement dans les contacts de nature « tip-to-tip » avec OprM, pourtant elle conduit à un meilleur rendement de formation de complexes tripartites MexA-MexB-OprM, mais aussi à la formation de complexes hybrides avec OprN et TolC, homologues d’OprM chez P. aeruginosa et E. coli, révélant ainsi un gain de résistance des bactéries aux antibiotiques. Une analyse de l’énergie d’hexamérisation de MexA montre que cette mutation favorise la formation de l’hexamère de MexA.Par ailleurs un déterminant structural pour OprM, également non impliqué dans les contacts « tip-to-tip » avec MexA, a été montré comme indispensable pour la formation du complexe tripartite. En effet, la délétion d’un fragment en position C-terminale a un impact négatif sur l’interaction de MexA avec OprM. De manière intéressante, MexAQ93R permet de restaurer la formation d’un complexe tripartite.Ces nouveaux déterminants structuraux mis en évidence pour l’interaction MexA-OprM et contrôlant la formation du complexe tripartite, constituent des éléments clés régissant l’assemblage, en plus de ceux décrits dans les contacts « tip-to-tip », et apportent un nouvel éclairage sur la séquence d’assemblage du complexe tripartite. L’identification de ces déterminants pourrait être capitale dans le cadre de recherches pharmaceutiques vouées à répondre à la résistance aux antibiotiques des bactéries pathogènes.

Faced with the growing threat of antimicrobial resistance, it is urgent to better understand the underlying mechanisms to develop solutions to combat multi-resistant strains but also to prevent their appearance. In this context, this PhD project aims to decipher the molecular basis of multidrug efflux, one of the most important mechanisms used by the bacteria to strike back against a wide variety of antibiotics.In Gram-negative bacteria, tripartite efflux pumps spanning the cell envelope can mediate the efflux of a wide variety of antimicrobial compounds, and participate to the antibiotic resistance. These efflux systems share a similar structural architecture composed of an inner membrane transporter and an outer membrane channel bridged by a periplasmic adaptor protein. The prototypical and clinically relevant efflux pump from Pseudomonas aeruginosa, MexA-MexB-OprM, is involved in the transport of drugs from the periplasm to the extracellular medium through the use of the proton gradient.Structural and biophysical studies have been carried out to decrypt the assembly mechanism of MexA-MexB-OprM. The strategy consisted in analyzing bipartite complex formation by biophysical methods (BioLayer Interferometry, Flow Induced Diffusion Analysis) and in determining the structure of tripartite complexes by negative-stain electron microscopy.Structural determinants for the MexA adaptor have been identified, allowing to extend its interaction to channel proteins other than OprM. The amino-acid substitution (Q93R) located in the six-helix bundle contacting OprM as described in the cryo-ME structure of the tripartite complex, plays a role in the assembly mechanism even though this mutation is not directly involved in tip-to-tip contacts with OprM. Indeed, the formation of tripartite MexA-MexB-OprM complexes has been obtained with a better yield. Hybrid complexes with OprN and TolC, homologs of OprM in P. aeruginosa and E. coli were formed thus revealing a gain in resistance of bacteria to antibiotics. Computational modelling predicts that this mutation promotes the formation of a MexA hexamer thermodynamically more stable. Moreover, a structural determinant for OprM, also not involved in tip-to-tip contacts with MexA, has been shown to be essential for the formation of the tripartite complex. Indeed, a C-terminal deletion has a negative impact on the interaction of MexA with OprM, preventing tripartite complex formation. Interestingly, replacing MexA by MexAQ93R restores the formation of a tripartite complex. These new structural determinants highlighted for the MexA-OprM interaction and controlling the formation of the tripartite complex, constitute key elements governing assembly, in addition to those described in the tip-to-tip contacts. They provide a new light on the assembly sequence of the tripartite complex. The identification of these determinants could be essential in the context of pharmaceutical investigation to obtain a response against antibiotic-resistant strains.