Mécanisme enzymatique d’une Peroxydase à hème d’origine bactérienne et couplage par chimérisation avec une Glucose oxydase.

Enzymatic mechanism of a bacterial heme peroxidase and coupling to a glucose oxidase with chimerisation.

• Auteur / Autrice : Claire Céré
• Direction : Claire Stines-Chaumeil
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 18/03/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Bio Physico Chimie (BIO2.0)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche Paul Pascal (Pessac ; 1963-....)
• Jury : Président / Présidente : Cécile Zakri
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Claire Stines-Chaumeil, Cécile Zakri, Gilles Truan, Sandrine Boschi-Muller, Xavier-François Santarelli
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Gilles Truan, Sandrine Boschi-Muller

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bactéries pathogènes

Peroxydases

Enzymologie

Résistance aux antibiotiques

Infections nosocomiales

Mots clés libres

Purification des protéines

Ingénierie des protéines

Chimères

Enzymologie

Peroxydases à hème

Protein purification

Protein engineering

Chimera

Enzymology

Heme Peroxidases

Résumé

Les infections nosocomiales urinaires représentent 30% des infections contractées lors d’un séjour à l’hôpital. La résistance aux antibiotiques des micro-organismes responsables de ces infections est à l’origine de ce nombre puisque les personnes atteintes deviennent de plus en plus difficiles à soigner. Depuis une dizaine d’années un nouveau challenge est apparu : développer de nouvelles techniques pour prévenir et guérir les infections nosocomiales (comme des composés chimiques microbiocides, des peptides ou des phages antimicrobiens). Notre stratégie est de produire un cathéter urinaire anti-adhérent et antimicrobien recouvert d’un système enzymatique couplé. La 1ère enzyme de ce système est la Glucose oxydase (GOx) dont le produit sert de substrat à la 2ème enzyme qui est une Peroxydase à hème. L’objectif de ces travaux de thèse a été de caractériser l’activité enzymatique de la Peroxydase à hème putative non connue de la littérature. Après avoir produit et purifié l’enzyme de manière originale, l’étude de la reconstitution puis du relargage de l’hème a été possible avec la mesure de l’extinction de fluorescence des tryptophanes et l’utilisation de l’acide 4-aminobenzoïque hydrazine, un inhibiteur de l’enzyme. Son activité d’halogénation a été mise en évidence à l’état stationnaire avec la caractérisation de ses constantes biochimiques pour chacun de ses substrats (les halo ou pseudo-halogénures SCN-, Br-, Cl- et l’H2O2) au stopped-flow et avec l’utilisation de la sonde fluorescente Aminophenylfluorescéine. La variation du pH et de la température lors de ces expériences a permis de fournir des informations concernant l’activité optimale de l’enzyme. L’étude de l’état pré-stationnaire a permis de mettre en évidence la présence d’un intermédiaire réactionnel lors du cycle catalytique de l’enzyme, appelé Composé I. Des activités Catalase et Peroxydase ont aussi été mises en évidence. La 1ère a été caractérisée par une diminution de l’absorbance à 240 nm, témoignant de la consommation de l’H2O2 par l’enzyme. La 2ème a été mise en évidence par l’oxydation de l’ABTS, substrat classique des Peroxydases, mis en évidence par l’augmentation de l‘absorbance à 436 nm. La stabilité à différentes températures, différents pH et dans différents milieux suggère que la Peroxydase a hème est active plusieurs mois, notamment à 4°C, ce qui est un résultat prometteur compte tenu de l’application finale souhaitée. La fusion des cadres ouvert de lecture codant une GOx et la Peroxydase à hème par deux techniques de génie génétique a permis l’obtention de protéines chimériques dans le but d’optimiser le transfert de substrat entre les deux sites actifs et d’augmenter la concentration locale des substrats au niveau des sites actifs. Cette nouvelle construction, aura aussi pour but de favoriser l’immobilisation du complexe enzymatique sur le cathéter urinaire. Tous ces résultats vont en faveur d’un système enzymatique couplé actif et stable dans le temps qui nécessite maintenant d’être étudié une fois fixé sur une surface siliconée. L’étude des composés microbiocides produits devra aussi être envisagée sur des souches pathogènes responsables des infections nosocomiales comme Candida albicans, Escherichia coli, Streptococcus aureus …

Hospital-acquired urinary tract infections account for 30% of infections contracted during a hospital stay. Antibiotic resistance of the microorganisms that cause these infections is at the root of this number, as the people affected are becoming increasingly difficult to treat. Over the past decade, a new challenge has emerged: the development of new techniques to prevent and cure nosocomial infections (such as microbicidals chemicals compounds, antimicrobial peptides or phages). Our strategy is to produce an anti-fouling and antimicrobial urinary catheter coated with a coupled enzymatic system. The 1st enzyme of this system is a Glucose oxidase (GOx) whose product serves as a substrate for the 2nd enzyme which is a heme peroxidase. The objective of this thesis work was to characterise the enzymatic activity of the putative heme peroxidase not known from the literature. After having produced and purified the enzyme in an original way, the study of the reconstitution and then the release of heme was possible with the measurement of the fluorescence quenching of tryptophans and the use of 4-aminobenzoic acid hydrazid, an enzyme inhibitor. Its halogenation activity was demonstrated in the steady state with the characterisation of its biochemical constants for each of its substrates (the halo or pseudo-halides SCN-, Br-, Cl- and H2O2) in stopped-flow and with the use of the fluorescent probe Aminophenylfluorescein. The variation of pH and temperature in these experiments provided information regarding the optimal activity of the enzyme. The study of the pre-steady state revealed the presence of an intermediate of reaction during the catalytic cycle of the enzyme, called Compound I. Catalase and Peroxidase activities were also demonstrated. The first was characterised by a decrease in absorbance at 240 nm, indicating the consumption of H2O2 by the enzyme. The second was evidenced by the oxidation of ABTS, a classic substrate of Peroxidases, evidenced by the increase in absorbance at 436 nm. The stability at different temperatures, pH and in different media suggests that the heme peroxidase is active for several months, especially at 4°C, which is a promising result considering the desired end-use application. The fusion of the open reading frames encoding a GOx and the heme peroxidase by two genetic engineering techniques allowed the acquisition of chimeric proteins with the aim of optimising the substrate channelling and increasing the local concentration of substrates at the active sites. This new construction will also aim to favour the immobilisation of the enzyme complex on the urinary catheter. All of these results support an active and time-stable coupled enzymatic system that now needs to be studied once fixed on a silicon surface. The study of the microbicidals compounds produced should also be envisaged on pathogenic strains responsible for nosocomial infections such as Candida albicans, Escherichia coli, Streptococcus aureus, etc.