Impact du microenvironnement tumoral acide sur l'expression des canaux ioniques et sur la progression de l'adénocarcinome canalaire pancréatique

The impact of the acidic tumor microenvironment on ion channel expression and regulation, in the progression of pancreatic ductal adenocarcinoma

• Auteur / Autrice : Julie Schnipper
• Direction : Halima Ouadid-Ahidouch
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie - Santé. Physiopathologie humaine
• Date : Soutenance le 10/11/2022
• Etablissement(s) : Amiens
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences, technologie et santé (Amiens)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de physiologie cellulaire et moléculaire (Amiens)
• Jury : Président / Présidente : Loïc Garçon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Luis Pardo, Henri Sevestre, Sébastien Roger
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Fabien Van Coppenolle, Laurent Counillon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Épigénétique

Canaux ioniques

Cancer

Pancréas

Mots clés libres

Cancer du pancréas

Microenvironnement tumoral

Pancreatic cancer

Tumor microenvironment

Ion channels

Epigenetics

Résumé

Le canal TRPC1 (pour transient receptor potential canonical 1) est l'un des canaux cationiques non sélectifs les plus impliqués dans plusieurs maladies, y compris la progression du cancer. Les TRPC peuvent être activés par différents stimuli physico-chimiques dont le pH. Par ailleurs, l'une des caractéristiques du cancer représente les variations pH extracellulaire, notamment dans l'adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP). Il existe de fortes indications quant à l'agressivité de l'ACP qui est causée par l'interaction entre le microenvironnement acide de la tumeur et la dérégulation des canaux ioniques. Cependant, cette interaction n'a jamais été étudiée. Lors de ce travail, nous avons étudié si TRPC1 ainsi que les fluctuations du pH acide du microenvironnement tumoral régulent la progression de l'ACP et plus particulièrement la prolifération et de migration cellulaires. Nous avons constaté que TRPC1 était surexprimé dans le tissu tumoral pancréatique par rapport au tissu normal, et dans la lignée cellulaire agressive PANC-1, par rapport à une lignée cellulaire de type canalaire, hTERT-HPNE. Pour déterminer si les fluctuations du microenvironnement acide de la tumeur affectent la dérégulation de TRPC1, les cellules PANC-1 ont été incubées dans un milieu présentant un pH de 7,4 ou 6,5 pendant 30 jours, après quoi les cellules ont été récupérées à pH 7,4 pendant 14 jours (7.4 R). L'adaptation acide (6.5) a réduit l'expression de la protéine TRPC1 mais a favorisé sa localisation membranaire par rapport au contrôle (7.4). Dans des conditions de pH 7,4R, les cellules cancéreuses présentaient une expression de TRPC1 exacerbée avec une localisation membranaire élevée, à la fois dans les modèles 2D et 3D. Nous avons constaté que les fluctuations de pH et l'invalidation moléculaire par siARN (KD) de TRPC1 affectaient respectivement la prolifération de PANC-1 dans un modèle 2D et sphéroïde. Dans notre modèle 2D, nous avons montré que TRPC1 KD affectait la progression à travers la phase G0/G1 dans toutes les conditions et la phase S lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu pH 7,4, et la phase G2/M dans les conditions pH 6,5 et 7,4 R. En outre, pH 6,5 a amélioré tandis que le KD de TRPC1 a diminué la migration cellulaire. De plus, nous avons constaté que TRPC1 interagissait fortement avec PI3K dans des conditions acides, et CaM dans toutes les conditions. Le KD de TRPC1 diminuait à la fois cette interaction et l'activation de AKT et ERK1/2. Enfin, l'entrée basale de Ca2+ a été significativement réduite par le KD de TRPC1 dans les conditions de pH 6,5 et 7,4R. La réduction de la concentration de Ca2+ extracellulaire a entraîné une diminution additionnelle de la prolifération et de la migration des cellules transfectées avec siTRPC1 cultivées à pH 6,5 et 7,4R, mais pas dans des conditions normales de pH 7,4. Collectivement, nos résultats montrent que TRPC1 est régulé positivement dans les tissus et lignées d’ACP. Le microenvironnement acide de la tumeur favorise sa localisation membranaire et son interaction avec PI3K/CaM. Enfin, le Ca2+ transitant par TRPC1 participe à la prolifération et à la migration cellulaires. De plus, nous avons effectué un criblage du profil d'expression des canaux ORAI, de leur partenaire STIM1, d'un canal sodique activé par le voltage (Nav1.6) et d'un canal ionique détectant l'acidité (ASIC1) dans les tissus et lignées d'ACP. Nous avons examiné si le microenvironnement acide affecte la régulation épigénétique des canaux ioniques. Nous avons constaté qu'ORAI3 était régulé positivement dans le tissu ACP par rapport au tissu normal, tandis que STIM1 et NaV1.6 étaient régulés négativement. De plus, ORAI3 était préférentiellement localisé au niveau membranaire dans le tissu tumoral. De plus, nos résultats préliminaires montrent que le microenvironnement acide de la tumeur n'affecte pas les niveaux de méthylation de la région promotrice des gènes codant pour ASIC1 ou TRPC1, mais également du gène SCN8A

The transient receptor potential canonical 1 channel (TRPC1) is one of the most prominent nonselective cation channels involved in several diseases, including cancer progression. TRPCs can be activated by different physio-chemical stimuli of their surroundings, for instance, pH. Another hallmark of cancer is the variable extracellular pH landscape, notably in epithelial cancers such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). PDAC progression and development are linked to the physiology and microenvironment of the exocrine pancreas. There are strong indications that PDAC aggressiveness is caused by the interplay between the tumor acidic microenvironment and ion channel dysregulation. However, this interaction has never been studied before. Here, we investigate if TRPC1 is involved in PDAC progression in the form of proliferation and migration and if the pH fluctuations of the acidic tumor microenvironment affect these processes. We found that TRPC1 was significantly upregulated in PDAC tumor tissue compared to adjacent normal tissue, and in the aggressive PDAC cell line PANC-1, compared to a duct-like cell line, hTERT-HPNE. To investigate if fluctuations of the acidic tumor microenvironment affect TRPC1 dysregulation, PANC-1 cells were incubated in a medium with a pH of 7.4 or 6.5 over 30 days, where after cells were recovered in pH 7.4 for 14 days (7.4R). Acid adaptation (6.5) reduced TRPC1 protein expression but favored its membrane localization compared to the control (7.4). pH recovery treatment (7.4R) resulted in an upregulation of TRPC1 expression with a high membrane localization, both in 2D and 3D models. We found that pH fluctuations and the siRNA-based knock-down (KD) of TRPC1 affected 2D and spheroid PANC-1 proliferation, respectively. In our 2D model, flow cytometry and cell cycle regulating protein immunoblotting showed that TRPC1 KD affected the progression through G0/G1 phase under all conditions and S-phase under control pH 7.4, which shifts to the G2/M phase in pH 6.5 and 7.4R. In addition, pH 6.5 enhanced, and the KD of TRPC1 decreased cell migration, respectively. Furthermore, we found that TRPC1 interacted strongly with PI3K under acidic conditions and CaM under all conditions, and a KD of TRPC1 decreased both this interaction and the activation of AKT and ERK1/2. Finally, basal Ca2+ entry was significantly reduced upon the KD of TRPC1 in pH 6.5 and 7.4R, where the entry was enhanced. The reduction of extracellular Ca2+ concentration resulted in an additional decrease in proliferation and migration of cells transfected with siTRPC1 growing in pH 6.5 and 7.4R, but not in normal pH 7.4 conditions.Collectively, our results show that TRPC1 is upregulated in PDAC tissue and cell lines. The acidic tumor microenvironment favors its plasma membrane localization, and its interaction with PI3K/CaM and Ca2+ entry leads to PDAC cells proliferation and migration. In addition, we performed an expression profile screening of ORAI channels, their partner STIM1, and a voltage-activated sodium channel (Nav1.6), and an acid-sensing ion channel (ASIC1) in PDAC tissues and cell lines, and investigated whether the acidic tumor microenvironment affects epigenetic regulation of ion channel expression. We found that ORAI3 was upregulated in PDAC tissue compared to normal tissue, where STIM1 and NaV1.6 were significantly downregulated. Moreover, ORAI3 was more localized in the plasma membrane in tumor tissue. Acid-adaptation had a differential effect on Ca2+ channel expression. Furthermore, our preliminary results show that the acidic tumor microenvironment does not affect the methylation levels of the ASIC1 or TRPC1 promoter region, but so some extend the SCN8A gene promoter