Modélisation des altérations de PRC2 dans les cancers, vers une meilleure compréhension du rôle de la mutation d'EZH2 dans les lymphomes folliculaires

Modeling PRC2 Alterations in Cancer, a Window Toward a Better Comprehension of EZH2 Mutation in Follicular Lymphoma

• Auteur / Autrice : Pierre Romero
• Direction : Anne Vincent-Salomon, Raphaël Margueron
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 14/10/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génétique et biologie du développement (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Franck Morschhauser
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sandrine Roulland, Adrian Bracken, Alexandra Traverse-Glehen
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sandrine Roulland, Adrian Bracken

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lymphome folliculaire

Protéine-2 homologue de l'activateur de Zeste

Complexe répresseur Polycomb-2

Épigénétique

Cancer

Mots clés libres

Epigenetique

PRC2

Cancer

EZH2

Lymphome folliculaire

Epigenetics

PRC2

Cancer

EZH2

Follicular lymphoma

Résumé

Le séquençage à haut débit a permis d’identifier dans les cancers le rôle des mécanismes généraux de contrôle de l’expression des gènes dont les modificateurs de la chromatine. Le complexe de répression transcriptionnelle Polycomb PRC2 catalyse la méthylation de H3K27, une marque associée aux gènes inactifs. PRC2 est l’objet de diverses altérations dans les cancers dont les conséquences sur l’activation des gènes varient selon le type tumoral et la nature de l’altération. Certaines de ces altérations résultent en une abrogation de H3K27me3, alors que la mutation Y646 de la sous-unité catalytique de PRC2, EZH2, qui est rencontrée dans 25% des lymphomes folliculaires (LF), induit une augmentation et une redistribution de H3K27me3. PRC2 peut donc être considéré comme suppresseur de tumeur ou comme oncogène selon le contexte. Cette thèse a eu pour objectif de clarifier les conséquences mécanistiques de ces altérations au travers de deux approches complémentaires. 1/ Approche mécanistique : Modélisation des altérations de PRC2 dans les cancers dans un modèle cellulaire isogénique : Nous avons utilisé une lignée de fibroblastes embryonnaires murins immortalisés (mEF) porteurs d’une délétion conditionnelle d’Ezh2 et récapitulant les génotypes Eed KO, H3.3K27M, Ezh2-Y641F/WT et Ezh2-Y641F/-+/- Ezh1 KO. La perte de fonction de PRC2 conduit à une diminution d’H3K27me3 et la réactivation de cibles de PRC2. En particulier, nous n’observons pas la génération de nouvelles cibles, ni le gain de cette marque en présence de H3.3K27M comme cela avait été décrit précédemment. De façon intéressante, les pertes de fonction de PRC2 sont associées à une augmentation globale de H3K27ac avec toutefois une diminution relative au niveau des pics. A l’inverse, la mutation gain de fonction Ezh2-Y641F induit une augmentation de H3K27me3 et ne nécessite pas la présence d’un allèle WT ou de Ezh1 pour assurer la mono-méthylation. Ezh2-Y641F entraîne une redistribution de H3K27me3 dans les cellules Ezh2-Y641F/WT avec un aplatissement des pics mais une propagation globale de la déposition. Cette altération des propriétés de PRC2 est due à un profond changement de la manière dont PRC2-Ezh2-Y641F interagit avec la chromatine car l’inhibition partielle de son activité ne restaure pas un profil de position de la marque sauvage. La réponse transcriptionnelle aux inhibiteurs d’EZH2 est quantitativement similaire entre les lignées WT et Ezh2-Y641F/WT mais la nature des gènes est différente: la lignée Ezh2-Y641F/WT montre de façon inattendue une réexpression de gènes impliqués dans la présentation antigénique, comme observé dans des modèles de lymphomes B. 2/ Approche translationnelle : Constitution d’une cohorte de lymphomes folliculaires EZH2 WT et mutés : Le séquençage des exons 16/18 d’EZH2 à partir de 160 cas de LF a permis d’identifier 18.8% de cas mutés. Sur une cohorte restreinte de 32 patients (21 mutés et 11 WT) avec un suivi clinique médian de 11.5 ans, nous avons réalisé, sur au moins un temps biopsique, une étude intégrative associant séquençage et CNV de 582 gènes impliqués dans le cancer, RNAseq et ChIPseq H3K27me3. Pour 13 cas, ChIPseq et RNAseq ont été réalisés de façon séquentielle sur >2 biopsies/patient. Nous confirmons la prévalence des mutations de KMT2D et CREBBP sans co-occurrence avec les mutations d’EZH2. La signature transcriptionnelle des cas mutés montre autant de gènes activés que réprimés, avec un enrichissement dans les voies du microenvironnement pour les gènes réprimés. La mutation induit une redistribution de H3K27me3 avec un enrichissement sur les corps des gènes et une diminution sur les régions promotrices. L’enrichissement sur les corps des gènes est plus marqué pour les gènes réprimés par EZH2-Y646, les gènes activés ne présentent pas de profile différents selon le génotype. Enfin, les enhancers spécifiques aux cellules B sont enrichis dans les cas mutés, en lien avec une répression transcriptionnelle différentielle.

Next generation sequencing unveiled the pivotal role in cancer of general mechanisms involved in the control of gene expression including chromatin modifiers. The Polycomb repressive complex 2 “PRC2” catalyzes the methylation of H3K27, a mark associated with inactive genes. PRC2 is found to be altered in various cancer types and the consequences of these alterations depend on both tumor type and the nature of the alteration. Some of them result in abrogation of the deposition of H3K27me3, whereas other, namely the mutation Y646 of the catalytic sub-unit of PRC2 EZH2, which is present in up to 25% of follicular lymphoma (FL), leads to both an increase and a redistribution of H3K27me3. Thus, PRC2 can be alternatively considered as tumor suppressor or as oncogene given the context. This PhD thesis aimed at clarifying the mechanistic consequences of these alterations through two complementary approaches. 1/ Mechanistic approach: Modeling main alterations of PRC2 in cancers in a isogenic cell line model: We used an immortalized murine embryonic fibroblast cell line (mEF) harboring a conditional deletion of Ezh2 and recapitulating Eed KO, H3.3K27M, Ezh2-Y641F/WT and Ezh2-Y641F/-+/- Ezh1 KO genotypes. Loss of function of PRC2 leads to decrease of H3K27me3 and a reactivation of PRC2 target genes. Consistently, we do not observe generation of new target genes nor gain of the mark upon H3.3K27M mutation in contrast to previous report. Interestingly, loss of function alterations of PRC2 are associated with a global increase of H3K27ac yet with a relative decrease of the height of the peaks. In contrast, the gain of function mutation Ezh2 Y641F induces an increase of H3K27me3, regardless of the presence of either an Ezh2 WT allele or Ezh1 to ensure monomethylation. Ezh2-Y641F leads to a redistribution of H3K27me3 in Ezh2-Y641/WT cells with a flattening of the peaks and a global propagation of the deposition. This alteration of PRC2 properties is due to a profound change in the way PRC2-Ezh2-Y641 interacts with chromatin since partial reduction of its activity does not fully restore a WT pattern of deposition. Transcriptional response to Ezh2 inhibitors is quantitatively similar between WT and Ezh2-Y641F/WT cells, but the nature of responsive genes is different: Ezh2-Y641F/WT cells unexpectedly re express genes involved in antigenic presentation, in a similar way as observed in some B cell lymphoma models. 2/ Translational approach: Constitution and follow-up of a cohort of follicular lymphoma cases WT and mutant for EZH2: Sequencing of exons 16/18 of EZH2 from DNA extracted out of samples from 160 FL cases allowed the identification of 18.8% mutated cases. In a restricted cohort of 32 cases (21 mutant EZH2, 11 WT) with a median follow-up of 11.5 years, we conducted an integrative study including coupled sequencing and CNV analysis of 582 genes involves in cancer, RNAseq and H3K27me3 ChIPseq. For 13 cases, ChIPseq and RNAseq have been performed in >2 longitudinal time-point samples/patient. We confirmed the high frequency of KMT2D and CREBBP mutations without co-occurrence with EZH2 mutations. Transcriptomic signature of EZH2-Y646 cases showed a similar number of up and down regulated genes, with an enrichment in pathways involved in microenvironmental crosstalk for the repressed genes. EZH2-Y646 induces a redistribution of H3K27me3 along with an enrichment at the gene bodies and a depletion at the promoter regions. Enrichment at the gene bodies is more marked on the downregulated genes in the mutant background, whereas upregulated genes do not show a noticeably different H3K27me3 pattern according to the genotype. Finally, B cell specific enhancers are enriched in H3K27me3 in EZH2 mutant cases, along with differential transcriptional repression compared with WT cases.