Le rôle de Cab45 dans le tri apical des GPI-APs et des protéines solubles dans les cellules MDCK polarisées

The role of Cab45 in the apical sorting of GPI-APs and soluble proteins in polarized MDCK cells

• Auteur / Autrice : Dandan Liu
• Direction : Stéphanie Lebreton, Chris Bowler
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 09/09/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Unité Trafic membranaire et pathogenèse
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Arnaud Echard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Grégoire Michaux, Delphine Delacour, Nathalie Sauvonnet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Grégoire Michaux, Delphine Delacour

Mots clés

Mots clés contrôlés

Polarité (biologie)

Épithélium

Acide folique

Mots clés libres

Récepteur de folate

Épithélium

GPI-AP

PLAP-Sec

Protéine soluble

Polarité

Golgi

Calcium

Folate receptor

Epithelial

GPI-AP

PLAP-Sec

Soluble protein

Polarity

Golgi

Calcium

Résumé

Les cellules eucaryotes disposent de la capacité de se polariser de façon transitoire ou permanente. La polarité cellulaire est fondamentale pour la fonction cellulaire et repose notamment sur l’établissement d’un trafic intracellulaire polarisé. Les cellules polarisées ont donc développé des mécanismes cellulaires hautement régulés afin d’établir et maintenir ce trafic intracellulaire polarisé essentiel à cette polarité cellulaire. L’appareil de Golgi et plus précisément le TGN est la plateforme majeure de tri des protéines et lipides au sein des cellules. Les cellules épithéliales polarisées se caractérisent par leur asymétrie de la membrane plasmique divisée en deux domaines, apical et basolatéral, distincts en composition protéique et lipidique mais aussi en fonction. Bien qu’étudiés depuis des décennies certains mécanismes sous-tendant l’établissement et le maintien de la polarité épithéliale sont toujours méconnus. Alors que les mécanismes de tri des protéines membranaires à la surface apicale ou basolaterale ont été bien identifié, ceux régissant le tri apical des protéines glypiées ou solubles sont toujours peu élucidés. Au cours de ces dernières années, nos études ont montré que le tri apical des protéines glypiées dans les cellules épithéliales polarisées reposent sur leur capacité à former des complexes de haut poids moléculaires ou oligomères ou cluster au niveau de l’appareil de Golgi. Plus récemment nous avons révélé que la formation de cluster de protéines glypiées au sein de l’appareil de Golgi régule le tri apical de ces protéines à la surface cellulaire mais également leur organisation à la surface membranaire apicale ainsi que leurs activités biologiques. Néanmoins, à part le rôle essential du contenu en cholestérol des membranes Golgiennes, les facteurs moléculaires régulant l’oligomérisation des protéines glypiées dans le Golgi sont inconnus. Ici on revèle pour la première fois le rôle critique des ions calcium au niveau du Golgi dans le tri apical des protéines glypiées. Plus précisément, une pompe à calcium et manganèse, SPCA1, située au niveau du TGN permet l’entrée d’ions calcium dans ce compartiment conduisant à l’oligomérisation de Cab45, une protéine Golgienne capable de lier le calcium, qui stabiliserait les clusters de protéines glypiées afin de permettre leur tri apical. Une diminution de l’expression de SPCA1 ou Cab45 réduit la capacité des protéines glypiées à former des clusters dans le Golgi conduisant à leur tri aberrant à la surface basolatérale. De plus, nous avons montré que cette même protéine Cab45 régule également le tri apical d’une protéine soluble secrétée depuis la membrane apicale dans les conditions contrôles PLAP-sec qui est une forme tronquée de la protéine glypiée PLAP à laquelle l’ancre GPI a été enlevé. En conclusion, ce travail révèle un rôle inattendu du calcium dans le tri apical des protéines glypiées et identifie SPCA1 et Cab45 comme étant les régulateurs de l’organisation de ces protéines glypiées en oligomère dans l’appareil de Golgi. Enfin, il est fascinant que la même protéine Cab45 puisse gouverner à la fois le tri apical 1) de protéines glypiées associées aux domaines membranaires enrichies en cholestérol et sphingolipides mais également 2) d’une protéine soluble reportée comme non-associée à ces mêmes domaines membranaires. Nos résultats nous permettent de mieux appréhender les mécanismes d’exocytoses dans les cellules épithéliales polarisées et confirment l’existence de nombreuses voies d’exocytoses différentes pour des protéines transmembranaires ou glypiées ou solubles.

Eukaryotic cells exhibit the capacity to polarize either transiently or permanently. In all cases cell polarity is fundamental for proper cellular functions and relies of polarized intracellular protein trafficking and secretion. Therefore, nature evolved highly elaborated and finely tuned machineries to sort and transport proteins to their correct destinations. Within the cell, the Trans Golgi network (TGN) is the main sorting hub allowing to selectively sort lipids and proteins. Polarized epithelial cells are characterized by the asymmetry of their plasma membrane divided into apical and basolateral domains that differ in protein, lipid composition and in function. Although studied since decades, how epithelial cell establish and maintain their polarity is still an open question in cell biology. While the sorting and transport of either apical or basolateral transmembrane proteins has well been studied, our knowledge regarding the mechanisms regulating the apical sorting of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins (GPI-APs) or soluble cargoes in polarized epithelial cells is more fragmented. In recent years, our group reported that cholesterol-dependent clustering of GPI-APs in the Golgi is the key step driving their apical sorting and their further plasma membrane organization and biological activities. However, the specific molecular factor regulating the formation of GPI-APs clustering in the Golgi is unknown. Here, we show that the clustering of GPI-APs in the Golgi relies directly on the levels of calcium within this organelle. Specifically, we further demonstrate that SPCA1, the TGN calcium/manganese pump that regulates Calcium entry in the TGN, and Cab45, a calcium-binding Golgi luminal resident protein, are essential for Golgi clustering of GPI-APs and therefore for their apical sorting. Silencing of SPCA1 or Cab45 in polarized MDCK cells impairs Golgi GPI-APs clustering leading to their basolateral mis-sorting. Intriguingly, we also found that Cab45 regulates the apical secretion of the soluble PLAP-sec protein (a truncated PLAP, apical GPI-AP, devoid of its GPI-anchor). Silencing of Cab45 results in the mis-secretion of PLAP -sec from the basolateral cell surface. In conclusion, this thesis reveals for the first time an unexpected role of calcium ions in the apical exocytosis of GPI-APs and identifies SPCA1 and Cab45 as master regulators of Golgi GPI-APs clustering. Additionally, it is fascinating that the same calcium-binding Golgi resident protein Cab45 regulates the apical sorting of i) raft-associated GPI-AP and ii) soluble PLAP-sec protein. While our discovery represents a fundamental advance in our general understanding of the exocytosis in polarized epithelial cells, they also greatly improve our knowledge on the machinery regulating polarized trafficking of GPI-APs and soluble cargoes.