Thèse soutenue

Caractérisation systématique d'un grand nombre de protéines associées aux microtubules à l'aide d'essais de reconstitution TIRF sans purification de protéines
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Auteur / Autrice : Jijumon A.S.
Direction : Carsten Janke
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
Date : Soutenance le 16/02/2021
Etablissement(s) : université Paris-Saclay
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Intégrité du génome, ARN et cancer (2010-....) - Cherry Biotech (Rennes)
référent : Faculté des sciences d'Orsay
Jury : Président / Présidente : Christian Poüs
Examinateurs / Examinatrices : Thomas Surrey, Isabelle Arnal, Laurent Blanchoin
Rapporteurs / Rapporteuses : Thomas Surrey, Isabelle Arnal

Résumé

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Le cytosquelette des microtubules (MTs) est constitué de filaments dynamiques impliqués dans une multitude de fonctions telles que la division cellulaire, le maintien de forme des cellules, les battements ciliaires ou encore la différenciation neuronale. Une régulation stricte des fonctions des MTs est donc d'une grande importance pour l'homéostasie cellulaire, et toute perturbation pourrait potentiellement conduire à des maladies comme le cancer, les ciliopathies ou la neurodégénérescence. Dans un contexte cellulaire, les propriétés des MTs peuvent être contrôlées par leurs interactions avec une grande variété de protéines associées (MT-associated proteins ; MAPs). Notre connaissance de ces interacteurs s'est continuellement enrichie au cours des dernières décennies, mais il n'existe à ce jour aucune étude systématique visant à décrire et à classer ces protéines en fonction de leurs mécanismes de liaison et de leurs effets structuraux sur les MTs. Dans mon projet de thèse, j’ai mis au point un essai permettant une analyse rapide et systématique à la base des lysats clarifiés de cellules humaines surexprimant une multitude des différents MAPs. Le comportement dynamique des MT en présence d'environ 50 MAPs différentes a été imagé à l'aide de la microscopie TIRF. Cela nous permet d'étudier le comportement des MAP dans une situation proche de leur environnement naturel, mais en éliminant la complexité de l'espace intracellulaire, telle que l'encombrement par des organelles et des filaments du cytosquelette à l'intérieur de l'espace intracellulaire confiné. En effet, la plupart des MAPs étaient bien solubles dans notre approche d'extraction, tandis que les approches de purification pour plusieurs d'entre elles ont conduit à leur précipitation, rendent les expériences de reconstitution in vitro classique impossible. Ma nouvelle approche m’a permis de définir plusieurs nouvelles protéines comme de véritables MAP. J’ai montré que des MAPs non-caractérisées auparavant ont des effets étonnamment différents sur la polymérisation et la structure des MTs, créant ainsi une variété de réseaux de MT distincts. J’ai également démontré que mon approche permet d'étudier les structures des MAPs associées aux MTs par cryo-microscopie électronique, ou d'étudier le dynamique des MTs porteuses de mutations trouvées dans les pathologies humaines. J’ai également démontré que mon approche permet à tester la sensibilité des MAPs aux modifications post-traductionnelles de la tubuline, ou d'étudier le rôle des MAPs dans les interactions entre l'actine et les MTs. Mon approche expérimentale permet donc de mieux comprendre comment les MAP et les MT contrôlent ensemble le fonctionnement du cytosquelette.