Une approche pour caractériser le coût de la sécrétion de protéines et quantifier l'efficacité de la bioproduction

Pipeline for the systematic characterization of heterologous protein secretory load to assess bioproduction efficiency

• Auteur / Autrice : Sebastián Sosa-Carrillo
• Direction : Grégory Batt
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences du vivant appliquées, biotechnologie et ingénierie des biosystèmes moléculaires
• Date : Soutenance le 15/12/2021
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Méthodes expérimentales et computationnelles pour la modélisation des processus cellulaires (InBio)
• Partenaire(s) de recherche : Partenaire de recherche : Institut Pasteur
• Jury : Président / Présidente : Cosmin Saveanu
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Cosmin Saveanu, Tom Ellis, Megan N. McClean, Fayza Daboussi, Nathalie Guivarc'h
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Tom Ellis, Megan N. McClean

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biomolécules

Protéines

Biologie systémique

Mots clés libres

Biologie systémique

Sécrétion de protéines

Bioproduction

Systems biology

Protein secretion

Bioproduction

Résumé

La bioproduction est un domaine de la biotechnologie qui vise à obtenir des produits d'intérêt en utilisant des systèmes biologiques comme usine biochimique. Elle devrait devenir l'une des technologies industrielles les plus importantes pour la production durable au cours des années à venir. Lors des dernières décennies, les levures ont été largement utilisées comme système modèle pour la bioproduction, de protéines d'intérêt thérapeutique ou industriel notamment. Cependant, en dépit d'importants efforts de recherche pour élucider la biologie des voies de sécrétion des protéines recombinantes, l'ingénierie des souches et l'optimisation des bioprocédés pour adapter la demande de production avec les capacités sécrétrices des cellules reposent encore largement sur une approche d'essais et d'erreurs. D'importantes inconnues subsistent concernant les goulots d'étranglement qui limitent la sécrétion des protéines complexes. Ces lacunes sont souvent liées aux limitations technologiques de notre capacité à contrôler étroitement la demande de production de protéines et à effectuer des mesures de sécrétion en temps réel. Pendant mon doctorat, j'ai développé une petite collection de souches de levure, produisant des protéines de complexités sécrétoires différentes, et j'ai caractérisé la production et la sécrétion de protéines, ainsi que le stress cellulaire, pour différents niveaux de demande à l'aide d'optogénétique. J'ai utilisé une plateforme automatisée de bioréacteurs qui permet de suivre le processus de production par cytométrie à haute résolution temporelle et sur de longues périodes de temps. J'ai également développé une méthode simple et générique qui permet de prendre des mesures rapides des niveaux de sécrétion directement à partir de la culture cellulaire. En combinant les données expérimentales et des méthodes computationnelles, j'ai développé un modèle mathématique capable de prédire la compétition entre la dégradation active des protéines et la sécrétion le long de la voie sécrétoire. J'ai quantifié les niveaux de demande au-delà desquels la réponse au stress se déclenche, la croissance cesse, et la dégradation domine la sécrétion. J'ai également constaté que dans des conditions de forte demande, l'hétérogénéité de la population peut limiter, voire réduire, les quantités de protéines sécrétées. Ces résultats devraient contribuer à une meilleure compréhension de la voie sécrétoire et permettre de rationaliser l'optimisation de la bioproduction de protéines.

Bioproduction is a field of applied biology that aims to produce goods of interest, mainly proteins or their reaction products, by using biological systems as a factory. It is expected to become one of the most important technologies for sustainable industrial production in the years to come. In the last decades, yeasts have been widely used as a model system for bioproduction. However, despite significant research efforts to elucidate the biology of recombinant protein secretory pathways, strain engineering and bioprocessing optimization to balance production demand with secretory cell capacity largely remains a trial-and-error based process. Important unknowns still remain regarding the bottlenecks that limit secretory function for complex proteins. Such knowledge gaps are often linked to technological limitations in our capacity to tightly control the protein production demand and to perform secretion measurements in real time. During my PhD, I developed a small collection of yeast strains, producing various proteins of different secretory complexity, and I characterized protein production and secretion, as well as cellular stress, for different levels of demand using optogenetics. I used an automated bioreactor platform that allows to follow the production process by cytometry at high temporal resolution and over long periods of time. I also developed a general and simple method that enables us to take rapid measurements of secretion levels directly from the cell culture. By combining experimental data and computational methods I developed a mathematical model that is able to predict the contribution of protein active degradation over secretion along the secretory pathway. I quantified the levels of demand beyond which stress response is triggered, growth ceases, and the degradation-secretion balance is lost in favor of degradation. I also found that under high demand conditions, population heterogeneity might limit, and even reduce, secreted protein levels. These results should contribute to a better understanding of the secretory pathway and should help streamline the optimization of protein bioproduction.