Caractérisation cellulaire de la prise en charge des vésicules extracellulaires et de la libération cytosolique de leur contenu dans les cellules receveuses

Cellular characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within acceptor cells

• Auteur / Autrice : Émeline Bonsergent
• Direction : Grégory Lavieu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et biologie du développement
• Date : Soutenance le 30/09/2021
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Immunité et cancer (Paris ; 2009) - Laboratoire Matière & Systèmes Complexes (Paris ; 2001-....)
• Jury : Président / Présidente : Catherine L. Jackson
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Catherine L. Jackson, Julie Gavard, Cédric Delevoye
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Julie Gavard, Cédric Delevoye

Mots clés

Mots clés contrôlés

Fusion membranaire

Cellules -- Interaction

Vésicules extracellulaires

Mots clés libres

Vésicules extracellulaires

Trafic intracellulaire

Libération de contenu vésiculaire

Fusion membranaire

Extracellular vesicles

Intracellular trafficking

Vesicular content release

Membrane fusion

Résumé

Les vésicules extracellulaires (EVs) sont des particules sécrétées par toutes les cellules, qui permettent le transfert de molécules biologiques (protéines, lipides, acides nucléiques) d'une cellule donneuse à une cellule receveuse. Ce rôle de transporteurs les rend intéressantes à la fois à un niveau fondamental pour comprendre leurs implications dans de nombreux processus physio/pathologiques, mais aussi à un niveau thérapeutique puisqu'elles représentent une opportunité de vecteurs pour des thérapies ciblées et personnalisées. Cependant, avant d'atteindre de telles applications, une caractérisation cellulaire et moléculaire de leur prise en charge par les cellules receveuses est nécessaire. Lors de cette thèse, deux études basées sur des approches in vitro et in cellulo ont été mises en place pour mieux comprendre ce processus. Des EVs, dont le contenu a été marqué, ont été incubées soit avec des membranes plasmiques purifiées, soit avec des cellules en culture. Le contenu des EVs a été suivi au cours de cette incubation pour quantifier quelle portion de ces vésicules peut être associée aux cellules receveuses, internalisées par celles-ci et principalement quelle quantité de contenu sera libéré dans le cytosol de ces cellules. Ces méthodologies ont permis d'obtenir une preuve formelle de l'échange intercellulaire de protéines médié par les EVs, ainsi que la première quantification de la prise en charge de ces EVs par des cellules HeLa (1% de prise en charge spontanée en 1 heure), et de la libération de leur contenu dans le cytosol receveur (30% du contenu des vésicules prises en charge). Cette prise en charge ne semble pas dépendre d'un récepteur spécifique. Les EVs peuvent être internalisées dans des compartiments endo/lysosomaux, où s'effectue vraisemblablement la libération du contenu vésiculaire dans le cytosol des cellules receveuses. En effet, cette libération nécessite une acidification des endosomes, la présence de protéines à la surface des EVs et de la membrane receveuse, et probablement une fusion membranaire. Ces résultats ouvrent la voie pour une caractérisation moléculaire de ce processus, afin d'identifier les acteurs clés de la prise en charge des EVs par les cellules receveuses.

Extracellular Vesicles (EVs) are membranous particles secreted by all cells. They are thought to transfer biomolecules (proteins, lipids, nucleic acids) from a donor cell, to an acceptor cell. This implies the involvement of EVs in numerous physio/pathological processes. EVs are also promising vectors for targeted delivery of therapeutics, which could revolutionize cell and gene therapy. However, much remains to be done at the fundamental level to better understand the cellular and molecular mechanisms that govern EV uptake and content delivery. During this PhD work, two assays were developed based on in vitro and in cellulo approaches to better understand this process. Extracellular vesicles containing labeled cargoes were isolated and mixed with purified plasma membrane or live cells. The fate of the EV-cargoes was then followed to identify their entry and delivery points within the acceptor cells, in a quantitative manner. This experimental strategy led to the first quantification of EV uptake (1% spontaneous rate in 1 hour) and content delivery (30% of the uptaken EV content) within HeLa cells. This EV uptake was not a saturable process and EV association with the acceptor cells was inhibited at 4°C. Confocal imaging showed that EVs can be internalized in endo/lysosomal compartments of the acceptor cells. These compartments appeared to correspond to the delivery point of the EV content, as endosomal acidification was required for EV content delivery. The EV content delivery step also required proteins on both EV and acceptor membranes, and was likely to include a membrane fusion event, as the expression of viral entry inhibitors, the IFITM proteins, decreased EV content delivery. These results pave the way to a detailed molecular characterization of this process, in order to finally identify the key molecular actors of EV uptake and content delivery by acceptor cells.