Sondes moléculaires à rétention de signal fluorescent répondant à une activité enzymatique

Molecular probes responding to enzymatic activity by releasing a solid-state fluorophore

• Auteur / Autrice : Alix Tordo
• Direction : Jens Hasserodt
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 10/12/2021
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Chimie (Lyon ; 2004-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : École normale supérieure de Lyon (2010-...)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de chimie. Lyon (2003-….)
• Jury : Président / Présidente : Sandrine Sagan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jens Hasserodt, Sandrine Sagan, Suzanne Fery-Forgues, Alexandre Specht, Yann Bretonnière, Laurent Vial
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Suzanne Fery-Forgues, Alexandre Specht

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cristaux

Sondes moléculaires

Imagerie moléculaire

Mots clés libres

Imagerie moléculaire

Sondes fluorogènes

Activité enzymatique

Cristaux

Fluorescence rouge et proche-infrarouge

Molecular imaging

Fluorogenic probes

Enzymatic activity

Cristals

Red and near-infrared fluorescence

Résumé

Cette thèse de doctorat traite de la conception et de l’évaluation de sondes moléculaires fluorogènes répondant à des activités enzymatiques dans des contextes biologiques d’intérêt. Ces sondes à trois composantes (une unité substrat enzymatique, un espaceur, un fluorophore) présentent un fort rapport signal sur bruit (grâce à son caractère OFF/ON), et une excellente rétention du signal au siège de l’activité enzymatique grâce à la libération d’un fluorophore précipitant, l’ELF-97. Des premiers résultats in vitro et in cellulo, très encourageants pour des sondes répondant à des peptidases ou glycosidases, ont récemment été obtenus dans l’équipe, et en font un outil de choix pour l’imagerie moléculaire. Le développement de nouveaux fluorophores avec des émissions décalées dans le rouge ou le proche infra-rouge par rapport à l’ELF-97 sera l’objet d’étude du premier volet, dans une optique d’expériences in vivo et/ou de multiplexing. En particulier, une étude de structure-propriétés de fluorescence sera conduite sur la famille des 2’-hydroxychalcone, à l’aide d’expériences de DRX. L’incorporation des fluorophores les plus prometteurs (c’est-à-dire répondant au mieux à notre cahier des charges) dans des sondes modèles ciblant la β-galactosidase, constituera naturellement le second chapitre. Une nouvelle méthodologie de couplage du fluorophore sur l’édifice global sera présentée, puis ces nouvelles sondes dites « rouges » seront testées in vitro et in cellulo. Enfin, l’amélioration de la sensibilité des sondes, libérant l’ELF-97 ou des nouveaux fluorophores rouges, par modification structurale des espaceurs constituera les deux derniers volets de ces travaux. Par l’introduction de charges positives nettes sur l’espaceur cyclisant, nous prouverons dans le troisième chapitre qu’une telle stratégie permet une meilleure pénétration cellulaire des sondes, et donc une meilleure sensibilité. Enfin, une nouvelle plateforme type PABA sera incorporée dans nos modèles de sondes répondantes, afin d’adapter notre technologie à la stratégie du multiple release. Pour ces deux projets, des validations in vitro, puis de quantification in cellulo seront également conduites.

This thesis deals with the conception and the evaluation of fluorogenic molecular probes responding to enzymatic activities in biological context of interests. Those three components-based probes (an enzymatic substrate unit, a spacer, a fluorophore) present a high signal over noise ratio (thanks to its OFF/ON character), and an excellent signal retention at the catalytic site through the release of a precipitating fluorophore, ELF-97. Promising in vitro and in cellulo results with peptidase or glycosidase probes have recently been obtained in our team, and revealed the efficiency of our technology for molecular imaging. The development of new fluorophores with redshifted emissions compare to the ELF-97 will be the aim of the first chapter of this manuscript, for in vivo and/or multiplexing applications. Especially, a structure – fluorescence property study will be conducted within the 2’-hydroxychalcone family, thanks to RXD experiments. Most promising fluorophores, responding as much as possible to our specifications, will be incorporated into probes targeting β-galactosidase, and will be the goal of the second chapter. A new coupling method to graft red fluorophore into global edifice will be presented. Then, those new probes will be validated in vitro and in cellulo. Furthermore, whatever releasing ELF-97 or red fluorophores, the aim of the two last chapters will be to improve the probe sensitivity through chemical modification of the spacer. By introducing positive charges within the cyclizing spacer, we will prove in the third chapter that this strategy allows a better probe cellular uptake, and so a better sensitivity. Finally, a new PABA-like platform will be incorporated into our model probes, in order to adapt our technology to the multiple release strategy. For those projects, in vitro validation and in cellulo quantification experiments will be conducted.