Les ARNs secrétés par le virus de l'hépatite B sont associés aux vésicules extracellulaires dans le surnageant d'hépatocytes infectés

Secreted hepatitis B virus (HBV)-RNA associates with extracellular vesicles in the supernatant of infected hepatocytes

• Auteur / Autrice : Delphine Bousquet
• Direction : Fabien Zoulim, Barbara Testoni
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Infectiologie
• Date : Soutenance le 26/11/2021
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon
• Jury : Président / Présidente : Massimo Levrero
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Fabien Zoulim, Barbara Testoni, Eloi Verrier, Reinhild Prange, Marintha Heil, Lorena Martin-Jaular, Philippe Roingeard
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Eloi Verrier, Reinhild Prange

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN viral

Exosomes

Vésicules extracellulaires

Virus de l'hépatite B

Mots clés libres

Virus de l'hépatite B

Vésicules Extracellulaires

Exosomes

ARNs viraux

Biomarqueur

Hepatitis B virus

Extracellular Vesicles

Exosomes

Viral RNAs

Biomarker

Résumé

L'infection chronique par le virus de l'hépatite B (VHB) demeure un problème de santé publique puisque les stratégies antivirales actuelles ne permettent pas d'obtenir une guérison complète. Le développement de biomarqueurs non invasifs est nécessaire pour améliorer la prise en charge des patients et l'évaluation de nouvelles thérapies. Les milieux de culture d’hépatocytes infectés par le VHB et traités ou non avec de la lamivudine (3TC) ont été collectés et concentrés. Les vésicules extracellulaires (VEs) ont été séparés par un gradient de densité. La distribution des protéines (virales ou marqueurs d’exosomes) et la distribution des ARN-VHB a été étudiée. L'analyse de suivi des nanoparticules (NTA), la microscopie électronique (MET) et l’analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse (MS) ont été utilisés pour caractériser les exosomes. L'expression de marqueur des exosomes a été détectée dans les fractions légères, dépourvues de protéine de capside. De plus, 15% des ARN-VHB ont été détectés dans ces fractions enrichies en exosomes, comme le confirment les analyses NTA et MET. L'analyse spécifique des ARN-VHB a suggéré que l'ARN de 3,5 Kb n’est pas l’unique espèce d’ARNs secrétée par les hépatocytes infectés. Le traitement avec le 3TC augmente la sécrétion d’ARN-VHB, principalement dans les fractions associées aux exosomes. Enfin, l’analyse MS a montré que le VHB impacte la sécrétion des protéines extracellulaires. Nos résultats montrent que les exosomes transportent des ARN-VHB. Ces connaissances aideront au développement et à l'interprétation des ARN sériques du VHB en tant que nouveau biomarqueur de l'infection chronique par le VHB.

Chronic Hepatitis B virus (HBV) infection remains a global health burden since current antiviral strategies are unable to achieve a complete cure. Non-invasive biomarkers are necessary to improve patients’ management and evaluation of new therapies. Supernatants from HBV-infected hepatocytes treated or not with lamivudine were processed through density gradient to allow physical separation of extracellular vesicles (EVs) and viral particles according to their buoyant density. Viral and EVs-associated proteins were analyzed, while HBV-RNAs were quantified by specific droplet digital (dd)PCR. Nanoparticle tracking analysis (NTA) and Transmission Electron Microscopy (TEM) were used to characterize the viral and non-viral components. CD9 expression, marker of exosomes/EVs, was detected only in lower density fractions, which were deprived of HBc. Interestingly, 15% of HBV-RNAs were detected in lighter fractions enriched for exosomes, as confirmed by NTA and TEM analysis. ddPCR analysis using assays spanning the 5’ region of 3.5Kb RNA or the HBx region suggested that 3.5 Kb RNA is the predominant but not the only viral RNA specie in cell supernatants. Treatment with 3TC increased the secretion of HBV-RNA, mainly in the fractions associated with exosomes. Finally, MS study revealed an impact of HBV on extracellular proteins secretion. Our results show evidence for EVs carrying HBV RNAs and will help understanding the molecular biology of serum HBV RNA secretion. This knowledge will aid the development and interpretation of serum HBV RNAs as a novel biomarker for chronic HBV infection.