Nouvel aperçu des partenaires moléculaires des snoRNP à boîtes C/D et des fonctions biologiques associées

Novel insight into box C/D snoRNP molecular partners and related biological functions

• Auteur / Autrice : Laeya Baldini
• Direction : Bruno Charpentier, Stéphane Labialle
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 15/01/2021
• Etablissement(s) : Université de Lorraine
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale BioSE - Biologie, Santé, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Ingénierie moléculaire et physiopathologie articulaire (Vandœuvre-lès-Nancy)
• Jury : Président / Présidente : Stéphanie Grandemange
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bruno Charpentier, Stéphane Labialle, Hervé Moine, Béata Erika Jady, Antoine Clery
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Hervé Moine, Béata Erika Jady

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dissertation universitaire

Épissage des ARN

Épissage (génétique)

Immunoprécipitation

Splicéosomes

Interactions ARN-protéine

Petits ARN

Mots clés libres

SnoARN à boîtes C/D

Biogénèse des snoRNP

ILF3

Nucléostémine

SNORD116

Épissage

Immunoprécipitation

C/D box snoRNA

SnoRNP biogenesis

ILF3

Nucleostemin

SNORD116

Splicing

Immunoprecipitation

Résumé

Le génome humain contient plus de deux cents gènes de petits ARN nucléolaires (snoARN) à boîtes C/D. Les snoARN C/D s'associent avec un jeu de quatre protéines cœurs pour catalyser les 2ʹ-O-méthylations des ARN ribosomiques (ARNr) et des petits ARN nucléaires (snARN). De manière intéressante, au cours de la dernière décennie, des études effectuées principalement sur des modèles de mammifères ont suggéré que les snoRNP sont impliquées dans d’autres processus cellulaires. Le génome humain contient de nombreux snoARN C/D orphelins qui ne possèdent pas de complémentarités évidentes avec les ARN cibles canoniques. En outre, plusieurs évidences ont souligné la possibilité que les snoARN s'associent avec de nouveaux partenaires protéiques et pourraient affecter le métabolisme et la prolifération des cellules. Enfin, certains snoARN sont spécifiquement dérégulés dans des pathologies comme le syndrome de Prader-Willi ou dans plusieurs cancers. Face à la complexité émergente des données issues de la littérature, nous émettons l'hypothèse que la formation, le devenir et les fonctions des snoRNP sont régulés par des facteurs protéiques non identifiés, dans des contextes physiologiques et pathologiques. Ainsi, nos principaux objectifs étaient d'étudier de nouveaux mécanismes moléculaires impliqués dans les fonctions cellulaires des snoRNP à boîtes C/D en utilisant une combinaison de plusieurs approches complémentaires, basée sur l'étude d’interactions ARN:protéine et ARN:ARN. Nous avons identifié que le snoARN orphelin SNORD116 possède des éléments antisens complémentaires de séquences contenues dans plusieurs ARNm et nous avons observé que la déplétion de SNORD116 par des oligonucléotide antisens (ASO) affecte leur taux à l’état d'équilibre. Nous avons recherché de nouveaux partenaires protéiques des snoRNP en utilisant une combinaison d'analyses par co-immunoprécipitation (IP) et spectrométrie de masse (MS). Nous avons identifié que GNL3/Nucléostemine, une protéine de liaison au GTP, interagit avec les complexes protéiques impliqués dans la biogenèse des snoRNP à boîtes C/D. Nous avons également observé que la protéine de fixation aux ARN, ILF3, interagit avec des snoRNP matures. La réduction du taux d'ILF3 par l’utilisation de siARN n'affecte pas le taux à l’équilibre des snoARN et module modestement leur association avec le ribosome. L'analyse des 2ʹ-O-méthylations portées par ARNr nous permettra de déterminer si ILF3 affecte les activités catalytiques des snoRNP. De plus, les données obtenues à partir d'IP-MS et de CLIP (crosslinking-immunoprecipitation)-microarray suggèrent que ILF3 impacte l'association des snoRNP avec des protéines de la machinerie d’épissage, ce qui a pour conséquence d’altérer le profil d’épissage de certains ARNm cellulaires.

The human genome contains more than two hundred C/D box small nucleolar RNAs (snoRNAs) genes. C/D snoRNAs associate with a set of four core proteins to catalyze 2ʹ-O-methylations of ribosomal RNAs (rRNAs) and small nuclear RNAs (snRNAs). Interestingly, over the past decade, studies done mostly on mammalian models suggested that snoRNPs are involved in unrelated cellular processes. The human genome encodes numerous orphan C/D snoRNAs that do not possess obvious complementarities with canonical target RNAs. Also, several lines of evidence pointed to the possibility that snoRNAs associate with other proteins than snoRNP core proteins and may affect cell metabolism and proliferation. Finally, specific snoRNAs are deregulated in pathologies such as the Prader-Willi syndrome or in several cancers. In front of this initially unsuspected complex picture, we emit the hypothesis that the formation, the fate, and the functions of snoRNPs are regulated by unappreciated protein factors, in physiological and pathological contexts. Thus, our main objectives were to study new molecular mechanisms involved in C/D box snoRNPs functions using a combination of several complementary approaches, based on the study of RNA:protein and RNA:RNA interactions. We identified that the orphan snoRNA SNORD116 possesses a complementarity antisense element with several mRNAs sequences and we observed that the depletion of SNORD116 by ASO affects their steady state levels. We searched for new snoRNP protein partners by a combination of co-immunoprecipitation (IP) and mass spectrometry (MS) analyses. We identified that GNL3/Nucleostemin, a GTP-binding protein interacts with protein complexes involved in C/D snoRNP biogenesis. We also identified that the RNA binding protein ILF3 interacts with mature snoRNPs. Depletion of ILF3 by siRNAs does not affect snoRNA steady state levels and modestly modulates their association with the ribosome. Analysis of rRNAs 2ʹ-O-methylations will be crucial to determine whether ILF3 affects snoRNPs catalytic activities. Moreover, data obtained from IP-MS and CLIP (crosslinking immunoprecipitation)-microarray suggested that ILF3 impacts the association of snoRNPs with the splicing machinery which leads to a change in the splicing pattern of several cellular mRNAs.