Caractérisation multi-échelle de capsides et de pseudo-capsides de bactériophages T5 par spectrométrie de masse

Multi-level characterization of bacteriophage T5 capsids and capsid-like particles using mass spectrometry.

• Auteur / Autrice : Kavya Clément
• Direction : Christophe Masselon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 24/09/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire biologie et biotechnologie pour la santé (Grenoble, Isère, France ; 2021-....) - BioSanté
• Jury : Président / Présidente : Cécile Breyton
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christophe Masselon, Joëlle Vinh
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mark Van Raaij, Richard B. Cole

Mots clés

Mots clés contrôlés

Résistance aux virus

Résistance aux bactériophages

Nanotechnologie

Virus

Spectrométrie de masse

Mots clés libres

Nanotechnologies

Virus

Spectrométrie de Masse

Virus

Mass Spectrometry

Nanotechnology

Résumé

La vaccination est la méthode la plus efficace de prévention et de contrôle des maladies infectieuses. Les stratégies actuelles de développement des vaccins ne permettent pas un large accès à la vaccination dans les pays en développement en raison de coûts élevés et de la nécessité de maintenir la chaine du froid. Les pseudo-particules virales (VLP) sont des structures virales recombinantes et qui possèdent les même propriétés immuno-protectrices que les virus natifs, mais ne sont pas infectieuses. Elles ont des applications en vaccination, mais également en thérapie génique et en présentation d’antigènes. Si la plupart des VLPs sont dérivées de pathogènes affectant les humains, les virus de bactéries ont été proposés comme plateformes de présentation d’antigènes. Les capsides de bactériophage T5 exposent à leur surface 120 copies d’une protéine modifiable, et constituent un modèle intéressant de structure VLP pour la présentation d’antigènes.La caractérisation d’assemblages supramoléculaires massifs composés de millions d’atomes, tels que les VLPs est difficile, mais requise pour la production de vaccins. La spectrométrie de masse par capteurs nano-electro-mécaniques (NEMS-MS) est une technologie prometteuse pour étudier ces entités biologiques imposantes qui ont pour l’instant échappé à la mesure de masse. Les NEMS sont des dispositifs nanométriques, (leviers ou poutres suspendues), qui vibrent à leur fréquence de résonance. Lorsqu’une particule se pose à leur surface, la fréquence de résonance décroit proportionnellement à la masse déposée.Cette thèse propose une étude des capsides de bactériophage T5 utilisant une multiplicité d’approches basées sur la spectrométrie de masse (MS). Le but principal est de caractériser l’intégrité et la stabilité des capsides de phage T5 en analysant leur masse totale par NEMS-MS. Un second objectif est de contribuer à la compréhension fine des processus d’assemblage des capsides en déterminant la stœchiométrie de la protéase de T5 par une approche de protéomique basée sur la MS.La première partie de cette étude est consacrée aux propriétés indépendantes de la masse des particules analysées qui peuvent affecter l’incertitude de mesure de masse par nano-résonateurs. Nous présentons une évaluation de la magnitude de ces effets sur la mesure de masse de capsides de bacteriophage T5 à l’aide de nano-poutres suspendues. Finalement, nous avons déterminé que la désolvatation incomplète des particules analysées affecte la mesure de masse bien plus largement que les paramètres physiques de la capside ou les imperfections de fabrication des dispositifs.La maturation de la capside de T5 débute avec l’activation d’une protéase appelée pb11, qui vient ensuite cliver d’autres protéines de structure. Malgré son importance pour la maturation de la capside, la quantité exacte de pb11 à chaque étape de l’assemblage est encore sujette à discussions. La seconde partie de ce travail décrit une stratégie expérimentale originale de protéomique ciblée pour déterminer la présence et le nombre de copies de cette importante protéine dans les capsides matures, en utilisant un concatémère (QconCAT) de deux peptides isotopiquement alourdis.En conclusion, ce travail aborde les divers attributs et paramètres qui peuvent affecter la détermination de la masse de capsides intactes par MS sur nano-résonateurs, et révèle le véritable nombre de copies de la protéase de T5 dans les capsides matures grâce à la protéomique par MS.

Vaccination is the most effective method of infectious disease prevention and control. Current vaccine development strategies do not provide broad access to vaccines in the developing world largely due to high costs and cold chain requirements. Virus Like Particles (VLP) are recombinant viral structures that exhibit immune-protective traits of native virus but are non-infectious. This developing technology has applications in the field of vaccines, gene therapy and antigen display. While most VLPs are derived from human pathogens, viruses infecting bacteria have recently been proposed as promising antigen display platforms. Bacteriophage T5 capsids exhibit 120 copies of a modifiable decoration protein at their surface, and could thus be used as a model for antigen-presenting VLP structures.Characterization of massive supramolecular assemblies composed of millions of atoms such as VLPs is very challenging, yet it is an important requirement for vaccine production. Nano-Electro-Mechanical-Sensors Mass Spectrometry (NEMS-MS), a novel method for single particle mass sensing, is a promising technology to investigate large biological species that have so far escaped mass characterization. NEMS are nanoscale devices, such as cantilevers or suspended beams, vibrating at their resonance frequency. When a particle lands onto the surface of a NEMS, the device’s resonance frequency shifts downwards in proportion to the added mass. Mass sensing can thus be performed by monitoring this frequency in real time.The present thesis focuses on studying bacteriophage T5 capsids from different perspectives using multiple mass spectrometry (MS) approaches. The primary aim is to assess the integrity and stability of the phage T5 capsids by analyzing their intact mass using NEMS-MS. The second aim is to contribute to an improved understanding of T5 capsid assembly process by determining the stoichiometry of the T5 capsid protease using MS based Proteomics.The first part of the our study investigates properties independent from particle mass that may influence the uncertainty in mass measurement using NEMS-MS, and how to deal with these issues. An evaluation of the magnitude of all these effects on bacteriophage T5 capsid mass measurements using doubly clamped beams is proposed. Finally, we determine that particle desolvation affects mass measurement more than the physical parameters of the capsid or uncertainties in device geometry.The maturation of the T5 capsid begins with the activation of a protease called pb11, which in turn processes other structural proteins. In spite of its importance for T5 capsid maturation, the exact quantity of pb11 at each stage of the assembly is still subject to debate. The second part of this work describes an original targeted proteomic strategy to determine the presence and copy number of this important protein in mature T5 capsids using a heavy isotope labelled quantification concatemer (QconCAT).In conclusion, this work addresses the various attributes and parameters affecting capsid mass determination using nano-resonator-based MS, and reveals the actual copy number of protease protein in mature T5 capsid using nanoLC-MS proteomics.