Etude de l'interaction entre les lectines et les lipopolysaccharides par Résonance Magnétique Nucléaire.

Deciphering the recognition patterns between lipopolysaccharides and human lectins using nuclear magnetic resonance spectroscopy

• Auteur / Autrice : Meriem Maalej
• Direction : Jean-Pierre Simorre, Antonio Molinaro
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie biologie
• Date : Soutenance le 16/04/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes en cotutelle avec Università degli studi di Napoli Federico II
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble, Isère, France ; 1992-....)
• Jury : Président / Présidente : Nicole Thielens
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Pierre Simorre, Antonio Molinaro, Delia Picone
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laura Russo, Latifa El Antak

Mots clés

Mots clés contrôlés

Résonance magnétique nucléaire

Escherichia coli

Interactions nanoparticule-bactérie

Relations hôte-bactérie

Lectines

Lipopolysaccharides

Mots clés libres

Interaction hote-Pathogéne

Lectines

Lps

Rmn

Host-Pathogen interaction

Lectin

Lps

Nmr

Résumé

Pour que les humains aient une survie stable contre les infections bactériennes, les cellules immunitaires ont une fonction bien définie qui leurs permet de distinguer les antigènes du soi et du non-soi. Escherichia coli est une bactérie à Gram-negative qui réside dans le microbiote humain en étant un microorganisme bénéfique mais qui peut être aussi pathogene. La tolérance des souches pathogène ou leur élimination est assuré par les récepteurs des cellules immunitaires tels que les Pathogen Recognition Receptors PRRs incluant les lectines du type-C CLRs qui interagissent d’une manière spécifique avec les carbohydrates. Le Lipopolysaccharide LPS est la signature des bactéries à Gram-negatives en étant à la fois un motif structural et de reconnaissance par la cellule hôte. La diversité structurale des LPS (i.e. différents niveaux d’hétérogénéités) et des lectines humaines (sites de liaison avec différentes architectures) leurs confère la particularité de contrôler des situations variables en ciblant des interactions spécifiques. Ainsi, comprendre les mécanismes des interactions LPS-Lectine est un défi et ceci exige une approche scientifique multidisciplinaire. Sur cette base, nous avons cherché à étudier l’interaction entre la lectine humaine Macrophage Galactose-type Lectine MGL, et, les LPSs des mutants E. coli R1, R3 et wild-type O157:H7. Les LPSs ont été extrait, purifiés et ensuite considérés pour les analyses de ce système d’interaction large et complexe. Nous avons étudié deux systèmes d’interaction LPS-Lectine entre: i) le domaine de reconnaissance des carbohydrates CRD de la MGL humaine et les versions solubles des LPSmoyennant des titrations RMN et études computationnels; ii) le domaine extracellulaire ECD de la MGL, et LPS, sous forme d’assemblages membranaire ou directement sur la surface des bactéries E. coli, à travers la STD-RMN combinée aux analyses computationnel,l’interférométrie BLI,la microscopie électronique EM et la microscopie à fluorescence couplée à la cyrtométrie en flux. Lorsque le CRD de la MGL est concerné, tous les LPSs exprimés par E. coli ont interagit avec une affinité de liaison faible, sur une surface élargie incluant un second site putatif, en plus du premier site calcique commun aux lectines type-C. Nos études ont fourni des résultats prometteurs sur la reconnaissance des LPS d’E. coli par le domaine ECD de la MGL humaine. La MGL trimérique interagit d’une manière spécifique avec le LOS, une structure courte du LPS exprimé chez la souche E. coli R1, principalement à travers la liaison au di-galactose l’épitope terminal du LOS. La constante de dissociation (Kd) a été estimée de l’ordre du nanomolaire indiquant une forte interaction. En outre, laspécificité de cette interaction a été confirméepar l’étude de la MGL marqué par un fluorophore où les bactéries E. coli R1 ont été visualisée, sous le microscope, en temps réel. Les bactéries E. coli R1 liées à la MGL étaient fluorescentes (jusqu’à 40% de la population bactérienne), exclusivement en phase stationnaire, tandis que les bactéries E. coli R3 ne manifestèrent aucune luminescence. Là encore, le choix de la MGL d’interagir d’une manière sélective et spécifique était orienté vers les glycoconjugués d’E. coli R1. Nous avons démontré que la MGL humaine ECD interagit fortement et spécifiquement avec les glycoconjugués d’E. coli R1 à la surface bactérienne à travers les motifs di-galactoses des LOSs. La contribution du second site de liaison sur la MGL CRD à la reconnaissance des glycoconjugués d’E. coli reste à analyser. Ce travail de doctorat a montré que, malgré la complexité du système d’interaction, il est possible d’étudier la reconnaissance des agents pathogènes, moyennant la combinaison d’approches. La possibilité d’analyser les données brutes obtenus sur les interactions LPS-Lectine (en état natif ou décomposé), de l’échelle atomique à la cellulaire, permettrait d’ouvrir de nouvel horizon pour l’étude des infections bactériennes.

For an equilibrated survival of humans against bacterial infections, immune cells have a well-defined function to distinguish between self and non-self structures. Escherichia coli is a Gram-negative bacterium that reside in the gut microbiota, either as a beneficial or harmful microorganism.The tolerance of pathogenic strains or their clearance is covered by many immune cell receptors such as Pathogen Recognition Receptors (PRRs) including C-type lectin receptors (CLRs) that specifically interact with carbohydrates moieties. Bacterial Lipopolysaccharide (LPS) is one of the bacterial signatures and it is the hallmark of Gram-negative bacteria. The molecular diversity of both LPS (i.e. various carbohydrates, lengths and heterogeneity levels) and lectins (variable binding sites architectures) would confer them the particularity of controlling variable situations and targeting specific interactions. The understanding of the mechanisms of LPS-Lectins interactions is challenging and requires an interdisciplinary approach.On the above basis, we sought to investigate the interaction between a C-type lectin i.e. human Macrophage Galactose-type Lectin MGL and LPSs (from E. coli R1, R3 mutants and O157:H7 strain). Bacterial LPSs were extracted, purified, and thereafter considered for the investigation of this large and complex interaction system. The difficult experimental handling of such native biomolecules directed the use of a divided set of approaches. . In fact, our scientific strategy includes the use of Nuclear Magnetic Resonance NMR spectroscopy, fluorescence microscopy, and molecular binding essays. By combining these methods, we studied two distinct Lectin-LPS interaction systems: i) the molecular interaction between the Carbohydrate Recognition Domain (CRD) of MGL and soluble LPS versions by using NMR titrations and computational methods; ii) the recognition of E. coli mutants and LPS glycoconjugates by the Extracellular Domain (ECD) of MGL at both molecular and cellular levels by STD-NMR combined with computational analyses, Biolayer Interferometry (BLI), Electron Microscopy (EM) and fluorescence microscopy coupled to flow Cytometry.When only the CRD of MGL is considered, all tested E. coli LPS were found to bind in the millimolar affinity range, to an extended interacting area that includes a putative secondary binding region, in addition to the canonical calcium binding site, common in C-type lectins.Spectroscopic and microscopic investigations provided promising results about the recognition between ECD MGL and E. coli LPS/LOS. Trimeric human MGL interacts specifically with E. coli R1 LOS mainly through binding to the terminal di-galactose moiety. In addition, the dissociation constant (Kd) was estimated to be in the nanomolar range thus indicating a strong molecular binding. Moreover, the specific interaction between fluorescently labelled human MGL and E. coli R1 bacteria was investigated by single-cell essays. MGL-bound E. coli R1 bacteria were fluorescent (up to 40% of the bacterial population), exclusively at stationary phase, whereas E. coli R3 were not. Here again, binding specificity and selectivity was confirmed for ECD MGL-R1 interaction system.We showed that MGL strongly and specifically interacts with E. coli R1 glycoconjugates at the surface of bacteria through its terminal di-galactose motif. The contribution of a putative secondary binding site on MGL in glycoconjugates recognition remains to be investigated. This PhD work showed that, despite the difficulties that such large system studies may encounter, many findings are attainable by using our scientific strategy. The possibility of investigating data from atomic to cellular scale on LPS-lectin interactions in either modified or native states, opens prominent horizons for the study of bacterial infections.