Comprendre les nouveaux biopolymères dérivés de protéines pour activer les dispositifs biomimétiques

Understanding novel protein-derived biopolymers to enable biomimetic devices

• Auteur / Autrice : Valeria Italia
• Direction : Donald Martin, Marco Maccarini, Kenith Meissner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Modèles, méthodes et algorithmes en biologie, santé et environnement
• Date : Soutenance le 14/12/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes en cotutelle avec University of Swansea (Swansea (GB))
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale ingénierie pour la santé, la cognition, l'environnement (Grenoble ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Techniques de l’ingénierie médicale et de la complexité - Informatique, mathématiques et applications (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Judith Peters
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Donald Martin, Sophie Schirmer, My Hedhammar
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Francesca Baldelli, Richard Campbell

Mots clés

Mots clés contrôlés

Langmuir-Blodgett, Couches de

Polymères biomimétiques

Autoassemblage

Protéines

Mots clés libres

Protéines

Auto-Assemblage

Biomimétiques

Biopolymers

Self-Assembly

Biomimetic

Résumé

Les matériaux à base de protéines font actuellement l'objet d'un vif intérêt de la part des chercheurs, car ils présentent un large éventail d'applications potentielles, telles que l'amélioration de la biocompatibilité des membranes biologiques pour les dispositifs médicaux implantés et la création de matériaux de plate-forme pour de nouveaux biocapteurs. Les monomères du facteur de transcription Ultrabithorax (Ubx) sont connus pour s'auto-assembler spontanément à une interface air-eau pour former une monocouche, qui a ensuite été utilisée comme base pour former des fibres biopolymériques. Dans le présent travail, nous utilisons une fusion d'Ubx avec la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) pour étudier les mécanismes de formation de films Ubx, en particulier pendant les premières étapes de l'agrégation des monomères Ubx à l'interface air-eau. La fusion de l'EGFP n'affecte pas la capacité d'Ubx à s'auto-assembler. Cependant, nous avons découvert que cette fusion joue un rôle important dans la dynamique de formation du film. En effet, les monomères Ubx précipitent dans l'eau et, vraisemblablement en raison des charges positives (charge nette prédite de +11), ils explosent sans contre-ions. Les charges négatives présentes dans l'EGFP empêchent l'explosion des monomères Ubx. Suite à des travaux précédents sur d'autres types de films protéiques, les paramètres critiques pour cette agrégation incluent la concentration de la protéine Ubx et la solution dans laquelle la protéine est suspendue. La composition de la solution a un impact sur la formation du film de surface de monomères Ubx et donc sur les propriétés de la membrane biopolymérique monocouche résultante. En effet, le monomère doit avoir une configuration déterminée pour pouvoir s'agréger. De plus, les monomères doivent se trouver à l'interface air-eau afin de s'agréger avec d'autres monomères. Il faut donc des conditions qui favorisent l'agrégation à la surface de l'eau. Notre hypothèse est que le temps d'attente pour l'agrégation est un paramètre essentiel à contrôler pour obtenir une structure ordonnée de la membrane biopolymérique. C'est-à-dire que les monomères ont besoin de temps pour changer de conformation, monter à la surface, puis commencer à s'agréger et à s'ordonner. Nous avons utilisé la technique de Langmuir-Blodgett (LB), la microscopie à angle de Brewster (BAM), l'ellipsométrie et la réflectométrie neutronique (NR) pour étudier l'agrégation des monomères Ubx et la formation de la biopolymère. Nos expériences ont indiqué que le temps d'attente entre l'introduction des monomères Ubx et la compression de la barrière LB était un paramètre critique supplémentaire dans la formation des membranes biopolymériques. De plus, nous avons développé une nouvelle technique d'analyse d'image basée sur l'autocorrélation des images de microscopie électronique à balayage (MEB) des membranes biopolymériques. Cette technique d'autocorrélation est applicable à toute image numérique, et dans nos expériences, elle a été utilisée pour quantifier la structure linéaire des membranes biopolymériques Ubx.

Protein-based materials are currently the subject of intense research interest since they have an extended range of potential applications, such as improved bio-membrane biocompatibility for implanted medical devices and the creation of platform materials for novel biosensors. Monomers from Ultrabithorax (Ubx) transcription factor are known to spontaneously self-assemble at an air-water interface to form a monolayer, which has then been used as a basis for forming biopolymeric fibers. In the present work we use a Ubx fusion with Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) to investigate the mechanisms of Ubx film formation, particularly during early stages of Ubx monomer aggregation at the air-water interface. Fusion of EGFP does not affect the ability of Ubx to self-assemble. However, we discovered this fusion plays an important role in the film-formation dynamics. In fact, Ubx monomers precipitate in water and, presumably due to the positive charges (predicted net charge of +11), they explode without any counter ions. The negative charges present in EGFP prevent the explosion of Ubx monomers. Following previous work on other types of protein films, critical parameters for this aggregation include the concentration of the Ubx protein and the solution in which the protein is suspended. The composition of the solution impacts the formation of the surface film of Ubx monomers and hence the properties of resulting monolayer biopolymeric membrane. Indeed, the monomer must have a determined configuration in order to aggregate. Moreover, the monomers must be at the air-water interface in order to aggregate with other monomers. Hence, conditions that promote aggregation at the surface of the water are required. Our hypothesis is that the waiting time for aggregation is an essential parameter to control to achieve an ordered structure of the biopolymeric membrane. That is, the monomers need time to change conformation, rise to the surface, then begin to aggregate and order themselves. We used the Langmuir-Blodgett (LB) technique, Brewster angle microscopy (BAM), ellipsometry and neutron reflectometry (NR) to investigate Ubx monomer aggregation and formation of the biopolymeric. Our experiments indicated that the waiting time between the introduction of Ubx monomers and the LB barrier compression was an additional critical parameter in formation of biopolymeric membranes. Moreover, we developed a new image analysis technique based on autocorrelation of Scanning Electron Microscopy (SEM) images of the biopolymeric membranes. This autocorrelation technique is applicable to any digital image, and in our experiments was used to quantify the linear structure of the Ubx biopolymeric membranes.