Bio‐impression d’un hydrogel cellularisé pour l'obtention de matrices conjonctives lâches orales pré-vascularisées utilisables en ingénierie tissulaire

Cellularized hydrogel bioprinting to obtain prevascularised oral soft connective tissue scaffolds for tissue engineering

• Auteur / Autrice : Rawen Smirani
• Direction : Adrien Naveau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Cellulaire et Physiopathologie
• Date : Soutenance le 07/12/2021
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Bioingénierie tissulaire
• Jury : Président / Présidente : Jean-Christophe Fricain
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Adrien Naveau, Jean-Christophe Fricain, Marie-Laure Colombier, Assem Soueidan, Valérie Orti
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Laure Colombier, Assem Soueidan

Mots clés

Mots clés contrôlés

Muqueuse orale

Fibroblastes

Bioimpression

Génie tissulaire

Mots clés libres

Ingénierie tissulaire

Bio-Impression par extrusion

Fibroblastes gingivaux

Hydrogel

Bioencre

Pré-Vascularisation

Tissue engineering

Extrusion-Based bioprinting

Gingival fibroblasts

Hydrogel

Bioink

Pre-Vascularisation

Résumé

Introduction : Bien que la muqueuse orale présente un potentiel de régénération efficace, certaines pertes de substances nécessitent une augmentation chirurgicale de la quantité et/ou de la qualité du tissu. La greffe autologue est la thérapeutique de référence mais possède trois inconvénients majeurs : une morbidité et une quantité de tissu limitée au niveau du site donneur ainsi qu’une connexion vasculaire lente du greffon au niveau du site receveur. L’ingénierie tissulaire (IT) peut pallier en partie ces problématiques en produisant des substituts tissulaires se rapprochant le plus possible des tissus natifs en termes de macro et micro architectures. La bio-impression 3D est une technique d’IT particulièrement prometteuse car elle permet de positionner les éléments cellulaires de façon précise tout en conservant leur viabilité. L’objectif de ce travail de recherche était donc d’obtenir un tissu mou conjonctif contenant des canaux verticaux et une pré-vascularisation horizontale à l’aide de la bio-impression 3D par extrusion (EBB) dans lequel la viabilité des cellules serait préservée in vitro pendant au moins un mois avec une étude pour la mise en place d’une application in vivo.Méthodes : Suivant la triade de l’IT cellules/scaffold/molécules, le modèle a été construit de la façon suivante : (a) les cellules étaient des fibroblastes gingivaux humains (hGF) issus de cultures primaires d’explants et des cellules endothéliales issues de la veine ombilicale (HUVEC) ; (b) le matériau (ou scaffold) a été sélectionné parmi de nombreux hydrogels afin de se rapprocher le plus des propriétés mécaniques du tissu tout en autorisant l’impression et la viabilité des cellules ; (c) aucune molécule bioactive n’a été ajoutée en dehors de celles déjà présentes dans les milieux de culture et de celles sécrétées par les cellules. Deux bio-imprimantes à extrusion ont été utilisées : MultiPrint (IUT de Bordeaux) dans un premier temps pour la prise en main puis 3D Discovery (RegenHU) pour les expériences in vitro. Les substituts bio-imprimés ont été maintenus en culture pendant 28 jours sans bioréacteur. Différents tests ont été effectués pour les caractériser : viabilité et activité cellulaire, caractérisation des cellules (cytométrie en flux et immunocytofluorescence) et quantification des pré-vaisseaux obtenus.Résultats : Après avoir démontré que les hGF pouvaient être bio-imprimés par extrusion dans un hydrogel et maintenus vivants en culture dans les substituts, une revue systématique de la littérature a été ciblée sur les stratégies utilisées en IT orale pour fabriquer des vaisseaux sanguins in vitro. Les techniques les plus utilisées étaient les co-cultures de cellules stromales et endothéliales en suivant des paramètres spécifiques . La mise au point des cocultures hGF/HUVEC a permis de découvrir des propriétés de certains fibroblastes qui, au contact des cellules endothéliales, se comportaient comme des cellules péri-vasculaires. Ceci a rendu possible l’ organisation et la stabilisation du réseau d’HUVEC in vitro pendant 30 jours. Enfin, ces co-cultures ont été bio-imprimées dans des formes contenant des canaux verticaux et l’organisation des vaisseaux dans les constructions a été suivie dans le temps in vitro avec une proposition de protocole in vivo chez le rongeur.Conclusion : Des substituts conjonctifs contenant des canaux verticaux et un pré-réseau vasculaire qui se maintient dans le temps sans bioréacteur peuvent être obtenus par EBB. Les propriétés péri-vasculaires d’une certaine partie des hGF jouent un rôle primordial. Il est dans un premier temps nécessaire de finir la preuve de l’intérêt de ces pré-vaisseaux avec des expérimentations in vivo pour prouver la connexion accélérée et efficace de la construction pré-vascularisée. Il sera ensuite possible de complexifier le modèle en ajoutant d’autres types cellulaires, en modifiant la forme 3D et en travaillant sur le gros animal pour se rapprocher des applications cliniques.

Introduction : Even though oral mucosa displays an efficient regenerative potential, tissue loss need a surgical increase of tissue quantity and/or quality. Autologous graft is the gold standard but possesses three major disadvantages : morbidity and limited quantity of tissue among the donor site and a slow vascular connection of the graft to the recipient site. Tissue engineering (TE) could partly help by manufacturing tissue substitutes that mimic native tissues in terms of macro and micro architecture. 3D bioprinting is a particularly promising TE technique because it enables cells positioning into precise patterns while keeping them alive. The aim of this research was to produce a gingival connective tissue substitute that contains vertical channels and a horizontal pre-vascularisation, using extrusion-based bioprinting (EBB). In this substitute, cell viability would be preserved in vitro during at least one month and the development of a protocol for future in vivo applications would be provided.Methods: Based on the TE triad cells/scaffold/molecules, the model was composed with the following features: (a) cells used were human gingival fibroblasts (hGF) from explant primary cultures and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC); (b) the scaffold was selected among various hydrogels in order to get the closest to native tissue properties while permitting cell printing and viability; (c) no bioactive molecule was used in addition to those already present in culture media and those secreted by cells. Two extrusion-based bioprinters were used : MultiPrint (Bordeaux IUT) first to get started then 3D Discovery (RgenHU) for in vitro experiments. Bioprinted substitutes were cultivated in vitro during 28 days without bioreactor. Different tests were performed to characterise them: cell viability and activity, cell characterisation (flow cytometry and immunocytochemistry) and preformed vessels quantification.Results: After showing that hGF could be bioprinted by extrusion within a hydrogel and could be kept alive in cultured substitutes, a systematic review of the literature focused on strategies used in oral TE to create blood vessels in vitro. The most reported techniques were cocultures of stromal and endothelial cells following specific parameters. The development of hGF/HUVEC cocultures allowed us to discover unusual properties of some fibroblasts which, when in close contact to HUVEC, displayed a perivascular cell behaviour. This made possible the organisation and stabilisation of the HUVEC network in vitro for 30 days. Finally, these cocultures were bioprinted and vessel organisation within constructions was followed throughout time in vitro and an in vivo protocol for rodents was proposed.Conclusion: Connective substitutes containing a pre-vessel network that remains throughout time without bioreactor were obtained using EBB. Perivascular properties of a part of hGF played a major role. First, it is necessary to finish the proof of concept by performing in vivo experiments in order to prove a faster and more efficient connection to the host vasculature with the pre-vascularised constructs. Then, it could be possible to complexify the substitutes by adding other cell types, modifying the 3D shape and working on bigger animal models to get closer to clinical applications.