Apport du séquençage à haut débit associé aux identifiants moléculaires uniques dans la prise en charge des tumeurs de la loge hypophysaire

Contribution of high throughput sequencing associated to unique molecular identifiers in the management of pituitary gland tumours

• Auteur / Autrice : Arnaud Lagarde
• Direction : Anne Barlier, Pauline Romanet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie santé. Génétique
• Date : Soutenance le 14/12/2021
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de génétique médicale de Marseille (Marseille)
• Jury : Président / Présidente : Frédéric Castinetti
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre Goudet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Philippe Bertolino, Éric Pasmant

Mots clés

Mots clés contrôlés

Néoplasie endocrinienne multiple de type 1

Retard de diagnostic

Mosaïcisme

Craniopharyngiome

Séquençage à haut débit

Mots clés libres

Dngs

Mosaïque

Nem1

DdPCR

Craniopharyngiome

Dngs

Mosaic

Men1

DdPCR

Craniopharyngioma

Résumé

Le séquençage à haut débit (NGS) autorise la possibilité de séquencer simultanément de nombreux gènes chez plusieurs patients, facilitant ainsi l’accès à un diagnostic. Malheureusement, de nombreux patients restent en errance diagnostique. Cet échec peut être dû au manque de connaissance actuelle sur les gènes responsables de la pathologie ou sur des lacunes technologiques propres au NGS. Mon travail de thèse a été d’améliorer le diagnostic génétique des tumeurs de la loge hypophysaire avec l’aide d’une technique de NGS associée à des identifiants moléculaires uniques : le digital NGS (dNGS). Cette amélioration technique permet d’identifier les duplicats de PCR générés au cours des étapes de préparation des échantillons en NGS et ainsi réduire le nombre de variants faux-positifs présents dans les faibles fréquences alléliques, situation rencontrée dans les analyses somatiques, dans l’analyse de l’ADN libre circulant (ADNlc) et dans le mosaïcisme génétique.Le premier objectif a été d’explorer dans une approche conventionnelle de séquençage NGS de nouveaux gènes candidats dans les adénomes hypophysaires isolés. Le second objectif était d’optimiser et d’évaluer cette technique de dNGS dans le dépistage génétique des formes en mosaïque du gène MEN1 responsable du syndrome de néoplasie endocrine multiple de type I (NEM1) dont l’une de ces principales atteintes est l’adénome hypophysaire.Le troisième objectif a été d’évaluer le dNGS pour des analyses d’ADNlc, d’une part pour le suivi des patients atteints d’une NEM1 en mosaïque, et d’autre part dans le suivi et le diagnostic d’une forme non héréditaire de tumeur de la loge hypophysaire, le craniopharyngiome.

The high-throughput sequencing (NGS) is now able to sequence many genes simultaneously in several patients, thus facilitating access to a diagnosis. NGS has thus become the preferred technique for the discovery of new genes. Unfortunately, many patients remain without diagnostic. This failure may be due to a lack of current knowledge about the genes responsible of the disease or to technological shortcomings. My thesis work was to improve the genetic diagnosis of pituitary with the help of a NGS technique associated with unique molecular identifiers (UMI), called digital NGS (dNGS) or Safe-Sequencing System. This technical improvement allows the identification of PCR duplicates generated during the NGS sample preparation steps and thus reduces the number of false-positive variants found in low allelic frequencies, without loss of sensitivity. This delicate situation is frequently encountered in somatic DNA, circulating free DNA (cfDNA) and genetic mosaicism analyses.The first objective was to explore in a conventional NGS sequencing approach, complemented by a review of published cases, new candidate genes involves in other neuroendocrine tumors (SDHx and MAX genes) in isolated pituitary adenomas. The second objective was to set up and evaluate the performance of this dNGS technique in the genetic screening of mosaic forms of the MEN1 gene in Multiple Endocrine Neoplasia syndrome type I (MEN1), in which pituitary adenoma is one of major lesions.The third objective was to evaluate the dNGS for cfDNA analyses, both for the follow-up of patients with mosaic MEN1, and for the follow-up and diagnosis of a non-hereditary form of pituitary gland tumour, craniopharyngioma.