Identification et caractérisation de gènes candidats pour la découverte de nouveaux mécanismes physiopathologiques à l'origine de l'anémie de Blackfan-Diamond

Identification and characterization of candidate genes to gain new mechanistic insight into Diamond-Blackfan Anemia pathophysiology

• Auteur / Autrice : Aurore Anton
• Direction : Patrick Blader, Pascale Dufourcq
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie du développement
• Date : Soutenance le 22/10/2020
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Biologie du Développement (Toulouse ; 1995-2020)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ribosomes

CRISPR-Cas9

Anémie

Mots clés libres

Ribosomopathies

Anémie de Blackfan-Diamond

Modèle poisson-zèbre

CRISPR/Cas9

Biogenèse des ribosomes

Hématopoïèse

Crêtes neurales

Cancer

Ribosomopathies

Diamond-Blackfan Anemia

Zebrafish model

CRISPR/Cas9

Ribosomes biogenesis

Hematopoiesis

Neural crest

Cancer

Résumé

Des mutations dans les gènes codant les protéines impliquées dans la biogenèse des ribosomes provoquent des maladies spécifiques chez l'homme, les ribosomopathies. L'une d'entre elles, l'Anémie de Blackfan-Diamond (ABD) se caractérise par une perte importante de cellules érythroïdes dans la moelle osseuse qui entraîne une anémie sévère et dans certains cas d'autres anomalies comme des malformations cranio-faciales. Bien que les mutations soient connues pour une vingtaine de gènes représentant environ 3/4 des patients atteints d'ABD, l'identification des gènes mutés dans les cas restants présente un enjeu majeur afin d'améliorer le diagnostic de la maladie et de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Le but de ma thèse a été de générer des modèles d'ABD chez le poisson-zèbre en utilisant la technique d'édition du génome CRISPR/Cas9 sur la base de nouveaux gènes candidats récemment identifiés par séquençage d'exomes chez les patients ABD Français. Mes résultats montrent que seuls les embryons homozygotes mutants pour l'un des gènes développent des phénotypes en lien avec l'ABD: une anémie sévère associée à des défauts généraux de développement comme un retard de croissance, une microcéphalie et l'absence de mâchoire. Quant aux deux autres gènes, bien que les embryons homozygotes mutants présentent des phénotypes développementaux, les résultats n'ont pas mis en évidence de défauts en lien avec la pathologie. Les mécanismes moléculaires à l'origine des symptômes observés chez les patients restent néanmoins à être caractérisés. La littérature et mes résultats montrent que les modèles intégrés actuels de l'ABD, ne reproduisent pas fidèlement la situation observée chez les patients. En effet, chez le poisson-zèbre les mutants dans les gènes ABD développent des phénotypes qui ne se limitent pas aux tissus affectés dans la pathologie humaine. Cela peut s'expliquer par le fait que chez l'homme les gènes responsables de l'ABD sont haploinsuffisants, alors que chez le poisson-zèbre, ils ont un comportement Mendélien récessif. Ainsi, parallèlement à mon travail de validation de nouveaux gènes de l'ABD, j'ai développé un système intégré vertébré modélisant l'ABD sur la base d'un gène causal préalablement identifié: TSR2 (20S rRNA maturation factor). Ce gène est localisé sur le chromosome X et la mutation faux-sens identifiée chez les patients se comporte comme un allèle récessif puisque seulement des patients garçons sont affectés. Cette particularité fait de ce gène un candidat idéal pour générer un modèle animal reflétant au mieux la génétique des patients ABD. J'ai généré une lignée mutante chez le poisson-zèbre, pour laquelle les embryons homozygotes mutants développent spécifiquement des défauts observés chez les patients: une anémie tardive ainsi que des défauts de mise en place des os de la mâchoire. [...]

Mutations in genes encoding proteins involved in ribosome biogenesis cause specific diseases in humans, called ribosomopathies. One of these, Diamond-Blackfan Anaemia (DBA), is characterized by a significant loss of erythroid cells in the bone marrow leading to severe anaemia and in some cases other abnormalities such as cranio-facial malformations. Until now, mutations are known for about 20 genes representing about 3/4 of patients with DBA, identifying the mutated genes in the remaining cases presents a major challenge in order to improve the diagnosis of the disease and discover new therapeutic targets. The aim of my thesis was to generate DBA models in zebrafish using the CRISPR/Cas9 genome editing technique on the basis of new candidate genes recently identified by exome sequencing in French DBA patients. My results show that homozygous embryos mutant for only one of these genes develop phenotypes that begin to resemble DBA, including severe anaemia associated with general developmental defects including growth retardation, microcephaly and lack of jaw; for the other two genes homozygous mutant embryos show developmental phenotypes unrelated to the pathology. The molecular mechanisms at the origin of the symptoms observed in the patients remain to be completely understood. The literature and my results show that the current integrated models of DBA do not satifyingly reproduce the physiopathology of patients. Indeed, in zebrafish, mutants in the DBA genes develop phenotypes that are not limited to the tissues affected in human pathology. This can be explained by the fact that in humans the genes responsible for DBA are haploinsufficient, whereas in zebrafish they have a recessive Mendelian behaviour. Thus, in parallel with my work to validate new DBA genes, I have established an integrated vertebrate model based on a previously identified causal gene: TSR2 (20S rRNA maturation factor). This gene is localized on the X chromosome and the missense mutation identified in patients behaves as a recessive allele since only male patients are affected. This particularity allows this gene to be an ideal candidate to generate an animal model that best reflects the genetics of DBA patients. I generated a tsr2 mutant in which the homozygous mutant embryos develop defects observed in patients: late anaemia and jaw bone placement defects. We also observed that, as described in DBA patients, adult heterozygous fish mutant for tsr2 are predisposed to developing cancers. This model could not only be used to understand how the dysfunction of a ubiquitous process such as ribosome biogenesis leads to specific defects, but also to explain the paradox of the transition from a hypo-proliferative state with phenotypes of bone marrow failure and anaemia, to a hyper-proliferative state leading to high cancer risks later in life. In the future, this model may improve the diagnosis of patients and lead to the emergence of new therapeutic targets by offering the possibility of performing pharmacological screening for the development of new treatments.