Rôles de la protéine cardio-protectrice, Carabine, et de ses partenaires nucléaires, MLL3 et CHD8, dans la reprogrammation génique au cours de l’hypertrophie cardiaque

Role of the cardioprotective protein, Carabin, and its nuclear partners, MLL3 and CHD8, in gene regulation during cardiac hypertrophy

• Auteur / Autrice : Roberto Pane
• Direction : Caroline Conte
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Maladies métaboliques et cardiovasculaires
• Date : Soutenance le 11/12/2020
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires (Toulouse ; 2011-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Agents cardioprotecteurs

Insuffisance cardiaque

Inhibiteurs de la calcineurine

Mots clés libres

Regulation Transcriptionelle

Epigenetique

Hypertrophie Cardiaque

Calcineurine

Transcriptional Regulation

Epigenetics

MLL3

Cardiac Hypertrophy

Calcineurin

Résumé

L'insuffisance cardiaque (IC) est le resultat d'une mauvaise hypertrophie cardiaque (HC), caractérisée par une croissance non mitotique des cardiomyocytes. Le HC est induit par une importante reprogrammation génique, qui voit la ré-expression de certains gènes fœtaux. Récemment, les analyses des marques histoniques ont montré que cette reprogrammation est associée à des changements épigénétiques dans les cardiomyocytes. Cependant, les mécanismes du remodelage de la chromatine impliqués dans l'activation de l'épigénome hypertrophique restent mal connus. Bisserier et al. (2015) ont identifié une nouvelle protéine cardioprotectrice, Carabin. Cette protéine est connue pour inhiber la phosphatase Ca2+/Calmoduline-dépendante, la Calcineurine (CaN), un activateur du HC. Afin de mieux comprendre le mécanisme d'action de Carabin, un criblage double hybride (CDH) d'une bibliothèque d'ADNc ventriculaire gauche a été réalisé. Nous avons identifié 47 interactants putatifs de Carabin, dont 15 étaient impliqués dans la régulation transcriptionnelle et 5 d'entre eux étaient des remodeleurs de chromatine. L’objectif de mes études de doctorat était d'abord de vérifier l'implication de ces remodeleurs de chromatine dans la réponse des cardiomyocytes au stress hypertrophique et de caractériser leur mode d'action lors de l'apparition du HC. Effectivement, trois d'entre eux, l'histone déméthylase JARID1B (Jumonji AT Rich Interactive Domain 1B), l'histone méthyltransférase MLL3 (Mixed-Lineage Leukemia Protein 3) et le remodeleur de chromatine ATP-dépendant CHD8 (Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 8) sont surexprimés dans les cœurs insuffisants humains et de souris et ont un effet pro-hypertrophique puissant dans les cardiomyocytes primaires. Cette première partie de mon projet a identifié MLL3, CHD8 et JARID1B comme des nouveaux remodeleurs de la chromatine impliqués dans l'activation du programme de gènes hypertrophiques dans les cardiomyocytes. Dans une deuxième partie, j'ai caractérisé les mécanismes moléculaires régulant l'expression des gènes induit par MLL3 et CHD8 en réponse au stress hypertrophique. J'ai montré que dans les cœurs sains, Carabin et MLL3 forment un complexe macromoléculaire avec CaN et la sérine / thréonine kinase 24 (STK24), qui était present dans le CDH. Dans ce complexe, MLL3 est phosphorylé par STK24. Sous stress hypertrophique, la libération de STK24 et de Carabin du complexe MLL3-CaN entraîne une activation de CaN et une déphosphorylation de MLL3, augmentant son activité d'histone méthyltransférase. De plus, dans ces conditions, j'ai observé une diminution de la liason CHD8-Carabin et une augmentation des interactions CHD8-MLL3. Ces résultats suggèrent que le dépôt de H3K4me1 médié par MLL3 peut être associé à un déplacement des nucléosomes par CHD8. Dans une troisième partie, j'ai étudié l'impact du knock down MLL3 sur l’instauration de l’HC. Pour cela, un virus adéno-associé cardiotrope (AAV9) exprimant trois shRNA ciblant MLL3 a été injecté à des souris soumises à un stress hémodynamique cardiaque par constriction aortique transversale. De façon intéressante, la régulation négative de l'expression de MLL3 a réduit l'hypertrophie cardiaque. J'ai ensuite identifié le programme du gène hypertrophique régulé par MLL3 en utilisant des expériences ChIP-seq réalisées sur la chromatine des cœurs de souris soumises ou non à un stress hémodynamique. En conclusion, CHD8 a donné des résultats très encourageants pour la prévention de l'IC, mais il nécessite une meilleure compréhension de ses implications moléculaires dans la pathologie. En revanche, MLL3, s'est avéré être un élément crucial dans la réponse hypertrophique médiée par CaN agissant directement sur la chromatine. Pour cette raison, le ciblage MLL3 peut représenter une stratégie intéressante pour le développement de nouvelles thérapies pour bloquer la progression du HC en HF.

Maladaptive cardiac hypertrophy (CH) is a dynamic process that lead to heart failure, a major cause of mortality worldwide. CH is induced by an important gene reprogramming, characterized by the re-expression of some fetal genes. Recently, genome-wide analyses of histone marks indicate that this gene reprogramming is associated with epigenetic changes in cardiomyocytes. However, the mechanisms of chromatin remodeling implicated in the activation of the hypertrophic epigenome are still poorly understood. Our laboratory identified a novel cardioprotective protein named Carabin. This protein inhibits the Ca2+/Calmodulin-dependent phosphatase, Calcineurin (CaN), a well-known and potent activator of CH. To better understand the mechanism of action of Carabin, a yeast two-hybrid screen (Y2HS) of a left human ventricular cDNA library was performed. We identified 47 putative interactants of Carabin, 15 of which were implicated in transcriptional regulation and 5 of them were chromatin remodelers. The aim of my PhD studies was first, to determine the involvement of these chromatin remodelers in cardiomyocyte response to hypertrophic stress and second, to further charactarize their mode of action at the onset of CH.Among the chromatin remodelers that we identified, three of them, the histone demethylase JARID1B (Jumonji AT Rich Interactive Domain 1B), the histone methyl transferase MLL3 (Mixed-Lineage Leukemia Protein 3) and the ATP-dependent chromatin remodeler CHD8 (Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 8) were overexpressed in human and mouse failing hearts and displayed potent pro-hypertrophic effect in primary cardiomyocytes. These data took me to identify MLL3, CHD8 and JARID1B as new chromatin remodelers implicated in the activation of the hypertrophic gene program in cardiomyocytes. Then, I characterized the molecular mechanisms of MLL3 and CHD8 regulating gene expression in response to hypertrophic stress. I showed that in basal conditions, Carabin and MLL3 formed a macromolecular complex together with CaN and the Serine/Threonine Kinase 24 (STK24), which was identified in the Carabin targeted-Y2HS. Specifically, I found that MLL3 was phosphorylated by STK24. Under hypertrophic stress, the release of STK24 and Carabin from MLL3-CaN complex led to CaN activation and MLL3 dephosphorylation, thereby increasing MLL3 histone methyltransferase activity. Moreover, in these conditions, I observed a decrease of CHD8-Carabin and an increase of CHD8-MLL3 interactions. These results suggest that MLL3-mediated H3K4me1 deposition may be associated with nucleosome displacement by CHD8.Finally, I studied the impact of MLL3 knock down on cardiac hypertrophy development. For that, I constructed a cardiotropic Adeno-Associated Virus serotype 9 expressing three MLL3-targeting shRNAs that was injected in mice subjected to a cardiac hemodynamic stress induced by transverse aortic constriction (TAC). Interestingly, I found that MLL3 knock-down reduced cardiac hypertrophy. I also identified the hypertrophic gene program regulated by MLL3 using ChIP-seq experiments performed on chromatin extracted from mice hearts subjected or noto TAC. In conclusion, CHD8 has given very encouraging results for HF prevention but it requires a better understanding of its molecular implications in the pathology. In contrast, MLL3, has proven to be a crucial element in the CaN-mediated hypertrophic response directly acting on chromatin. For this reason, MLL3 targeting can represent an interesting strategy for the development of new therapies to slowdown or even block HF progression.