L'imagerie cellulaire à haut débit révèle le contrôle de la synapse immunologique par le cytosquelette d'actine

High content cell imaging reveals actin cytoskeleton-mediated control of the immunological synapse

• Auteur / Autrice : Yolla German
• Direction : Loïc Dupre, Kaan Boztug
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 25/02/2020
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Physiopathologie de Toulouse-Purpan (Toulouse ; 2002-2020)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules NK

Imagerie médicale

Lymphocytes -- Immunologie

Mots clés libres

Cytosquelette d’actine

Lymphocytes cytotoxiques

Synapse immunologique

Imagerie à haut débit

Actin cytoskeleton

Cytotoxic lymphocytes

Immunological synapse

High content imaging

Résumé

Les lymphocytes cytotoxiques dépendent du remodelage du cytosquelette d'actine pour atteindre leur fonction. En particulier, les lymphocytes T cytotoxiques et les cellules NK assemblent la synapse immunologique (SI), structure complexe riche en actine qui permet l'interaction avec des cellules cibles et la distribution polarisée de granules lytiques (GL). Bien que le remodelage du cytosquelette d'actine soit connu pour être une force motrice de l'assemblage et de la dynamique de la SI, la compréhension du contrôle moléculaire du remodelage de l'actine soutenant la dynamique de la SI reste fragmentée. Ce projet de thèse a consisté à développer une approche d'imagerie à haut débit pour définir de manière impartiale les métriques de la SI des lymphocytes T et NK et caractériser les exigences d'intégrité du cytosquelette d'actine dans l'organisation de l'architecture de la SI.À cette fin, la stimulation et coloration des lignées cellulaires et cellules primaires dans des plaques à puits multiples et l'acquisition d'un ensemble unique d'images confocales avec un imageur à haut contenu entièrement automatisé ont été optimisées. Les images ont été analysées avec deux pipelines complémentaires avec CellProfiler pour définir les caractéristiques morphologiques associées aux différents traitements et à l'état de la maladie. Nous avons d'abord extrait 16 caractéristiques morphologiques se rapportant à la F-actine, LFA-1 ou aux GL, sur la base d'une connaissance préalable de l'assemblage de la SI, et inclus des caractéristiques relatives au noyau. Nous montrons que l'assemblage de la SI dans les lignées est caractérisé par une augmentation de l'intensité de la F-actine et la surface cellulaire. Pour les cellules Jurkat, nous rapportons une augmentation de l'intensité et de la surface LFA-1, et de la de la détection des LG sur le plan SI pour les cellules NK-92. Le traitement des cellules NK-92 avec 7 drogues affectant différents aspects de la dynamique de l'actine et l’étude des effets associés sur les caractéristiques de la SI montrent des effets dépendants de la concentration sur l'intensité de l’actine et sur la polarisation des GL. De plus, un profilage morphologique à haute résolution basé sur> 300 caractéristiques montre que chaque drogue inflige des altérations distinctes sur la morphologie de la SI. Nous avons appliqué ce pipeline à des cellules NK primaires isolées du sang de donneurs sains. Des caractéristiques morphologiques distinctes définissent les cellules NK de différents donneurs, soulignant la sensibilité de notre approche, mais révélant également une variabilité insoupçonnée des morphologies des cellules immunitaires parmi les donneurs. Nous avons appliqué notre approche aux cellules T CD8+ primaires de patients présentant une immunodéficience rare due à des mutations dans le gène codant pour le régulateur d'actine ARPC1B. La carence en ARPC1B entraîne une diminution de l'intensité de l'actine et de la polarisation des GL. Cela nous a incités à évaluer la capacité lytique de ces cellules, qui a été considérablement réduite. Ces résultats illustrent comment l'analyse systématique de la SI pourrait être utilisée pour aider à l'exploration des défauts fonctionnels des populations de lymphocytes dans des contextes pathologiques.En conclusion, notre étude révèle que, bien que l'assemblage de la SI puisse être caractérisé par quelques caractéristiques telles que l'intensité de l'actine et la propagation cellulaire, la capture de fines altérations résultant de la dérégulation du cytosquelette nécessite une analyse à haut débit. Le pipeline développé est prometteur pour le profilage morphologique des lymphocytes de patients atteints d'immunodéficiences primaires dont le défaut génétique n'a pas encore été identifié. De plus, le pouvoir discriminant de notre approche pourrait être exploité pour caractériser la réponse des lymphocytes à divers stimuli et surveiller leur activation dans de multiples pathologies et traitements.

Cytotoxic lymphocytes rely on actin cytoskeleton remodeling to achieve their function. In particular cytotoxic T lymphocytes and NK cells assemble the immunological synapse (IS), a complex actin-rich structure that allows the interaction with target cells, such as infected cells or tumor cells, and permits the polarized delivery of lytic granules. Although actin cytoskeleton remodeling is known to be a driving force of IS assembly and dynamics, our understanding of the molecular control of actin remodeling sustaining IS dynamics remains fragmented. This PhD project consisted in developing a high-content imaging approach to unbiasedly define the metrics of IS from human T and NK lymphocytes and to characterize the requirements for actin cytoskeleton integrity in organizing the IS architecture.For that purpose, the stimulation and staining of cell lines and primary cells in multiwell plates and acquisition of a unique set of >100.000 confocal images with a fully automatized high-content imager was optimized. The images were analyzed with two complementary CellProfiler analytical pipelines to characterize the morphological features associated with different treatments and disease status. We first extracted 16 morphological features pertaining to F-actin, LFA-1 or lytic molecules based on prior knowledge of IS assembly, and included features pertaining to the nucleus. We show that IS assembly in Jurkat and NK-92 cells is characterized by increased F-actin intensity and cell area. For Jurkat cells, we report an increase in LFA-1 intensity and surface area, and for NK-92 cells an increase in lytic granule detection at the IS plane. We then treated NK-92 cells with seven drugs known to affect different aspects of actin dynamics and investigated the associated effects on IS features. We report concentration dependent effects, not only on F-actin intensity, as expected, but also on lytic granule polarization. Furthermore, using a high-resolution morphological profiling based on >300 features, we show that each drug inflicts distinct alterations of IS morphology. In a next step, we applied our experimental pipeline to primary NK cells isolated from the blood of healthy donors. Distinct morphological features were characterized among the NK cells from different donors, highlighting the sensitivity of our approach, but also revealing an unsuspected variability of immune cell morphologies among donors. We then further applied our approach to primary CD8+ T cells from patients with a rare immunodeficiency due to mutations in the gene encoding the actin regulator ARPC1B. ARPC1B deficiency results in decreased F-actin intensity, as well as in lytic granule polarization. This prompted us to assess the ability of these cells to kill target cells, which was markedly reduced. These results illustrate how the systematic analysis of the IS might be used to assist the exploration of fonctional defects of lymphocyte populations in pathological settings. In conclusion, our study reveals that although assembly of the IS can be characterized by a few features such as F-actin intensity and cell spreading, capturing fine alterations of that complex structure that arise from cytoskeleton dysregulation requires a high-content analysis. The pipeline we developed through this project holds promises for the morphological profiling of lymphocytes from primary immunodeficiency patients whose genetic defect has not yet been identified. Moreover, the discriminative power of our high-content approach could be exploited to characterize the response of lymphocytes to various stimuli and to monitor lymphocyte activation in multiple immune-related pathologies and treatment settings.