Ingénierie métabolique de la voie de N-Glycosylation chez la diatomée Phaeodactylum tricornutum

Metabolic engineering of the N-glycosylation pathway in the diatom, Phaeodactylum tricornutum

• Auteur / Autrice : Rodolphe Dumontier
• Direction : Muriel Bardor, Patrice Lerouge
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences agronomiques, biotechnologies agro-alimentaires
• Date : Soutenance le 18/09/2020
• Etablissement(s) : Normandie
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement de préparation de la thèse : Université de Rouen Normandie (1966-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de glycobiologie et matrice extracellulaire végétale (Mont Saint-Aignan (Seine-Maritime) ; 2009-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Paul Cadoret, Vincent Ferrières, Fayza Daboussi, Bruno Saint-Jean, Alain Mareck
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Paul Cadoret, Vincent Ferrières

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transformation génétique

Glycosyltransférases

Biomédicaments

Anticorps monoclonaux

Diatomées

Glycosylation

Mots clés libres

Phaeodactylum tricornutum

N-glycanne

N-acétylglucosaminyltransférase I

Humanisation

Anticorps monoclonaux

Phaeodactylum tricornutum

N-glycans

N-acétylglucosaminyltransférase I

Humanization

Monoclonal antibodies

Résumé

Le marché des anticorps monoclonaux représente actuellement la majorité des protéines recombinantes à intérêt thérapeutique. Les difficultés liées à la production de tels anticorps dans des cellules de mammifères, ont poussé la communauté scientifique à envisager des organismes alternatifs pour leur production. Récemment, les microalgues ont montré leur capacité à produire des anticorps monoclonaux fonctionnels. Il est cependant nécessaire de modifier la glycosylation naturelle de ces microalgues afin qu’elles produisent des anticorps pouvant être utilisés pour certaines applications thérapeutiques chez l’Homme. Dans ce contexte, l’étude de la N-glycosylation de la diatomée Phaeodactylum tricornutum a été réalisée. Cette étude a consisté dans un premier temps à déterminer la structure du précurseur oligosaccharidique des N-glycannes des protéines formées dans le réticulum endoplasmique. Les résultats ont permis de montrer la synthèse par la diatomée d’un précurseur tronqué d’un glucose comparé à la majorité des eucaryotes. Dans un second temps, il a été nécessaire de déterminer la structure détaillée des N-glycannes oligomannosidiques. Ces résultats ont permis d’établir que les structures Man9GlcNAc2 et Man5GlcNAc2 synthétisées sont similaires à celles retrouvées chez les mammifères. De plus, le Man5GlcNAc2 synthétisé est l’isomère substrat accepteur de la N-acétylglucosaminyltransférase I (GnT I) qui catalyse l’étape primordiale initiant la synthèse des glycannes complexes. Cette étude a donc permis d’initier l’humanisation de la voie de la Nglycosylation par la sur-expression de la GnT I chez la diatomée afin d’amplifier les proportions en Nglycannes complexes portant des résidus N-acétylglucosamine en position terminale.

Currently, monoclonal antibodies represent the major class of recombinant proteins used for therapeutical applications in humans. The constraints due to the production of these monoclonal antibodies in mammalian cells led scientists to develop alternative expression system for the production of monoclonal antibodies. Recently, microalgae have been shown to be able to produce functional monoclonal antibodies. However, the engineering of the N-glycosylation pathway in these microalgae is required in order to optimize the effector functions of the algae-made antibody for some therapeutic applications. In this context, this PhD thesis focused on the study of the N-glycosylation of the diatom Phaeodactylum tricornutum. Initially, we focused on the structural analysis of the oligosaccharide precursor synthesized in the endoplasmic reticulum. The results showed that P.tricornutum synthesizes a truncated precursor as compared to the other eukaryotes. Then, I have investigated the detailed structure of the oligomannosidic N-glycans and demonstrated that the Man9GlcNAc2 and Man5GlcNAc2 synthesized were similar to those found in mammals. In addition, the Man5GlcNAc2 synthesized is the acceptor isomer for the N-cetylglucosaminyltransferase I (GnT I) which initiates in eukaryotes the synthesis of complex-type N-glycans. Humanization of the N-glycosylation pathway was finally iinitiated by over-expression of the GnT I in the diatom in order to increase the amounts of complex N-glycans carrying N-acetylglucosamine residues in the terminal position.