Les Mycotoxines du mil : occurrence et flore fongique

Mycotoxins of millet : Occurrence and Fungal Flora

• Auteur / Autrice : Hela Houissa
• Direction : Sabine Schorr-Galindo, Abdelwahed Ghorbel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologie et microbiologie
• Date : Soutenance le 15/12/2020
• Etablissement(s) : Montpellier en cotutelle avec Université de Tunis El-Manar. Faculté des Sciences de Tunis (Tunisie)
• Ecole(s) doctorale(s) : GAIA (Montpellier ; École Doctorale ; 2015-...)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Qualisud (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Najla Sadfi-Zouaoui
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sabine Schorr-Galindo, Abdelwahed Ghorbel, Najla Sadfi-Zouaoui, Florence Mathieu, Mohamed Hammami, Didier Montet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Florence Mathieu, Mohamed Hammami

Mots clés

Mots clés contrôlés

Millets

Fusarium

Aspergillus

Mycotoxines

Mots clés libres

Millet perlé

Mycotoxines

Aspergillus

Fusarium

Alternaria

Pearl Millet

Mycotoxins

Aspergillus

Fusarium

Alternaria

Résumé

La présente étude a pour principal objet de dresser un profil complet des différentes mycotoxines et des espèces fongiques toxinogènes se développant sur le millet perlé tunisien (Pennisetum glaucum (L) R.Br. Un total de 220 échantillons collectés auprès des agriculteurs (n=144) et de points commerce (n=76) ont été analysés par la méthode multi-analyte par LC/ESI-MS/MS. L’isolement mycologique a été effectué par la méthode « direct plating » et l’identification des espèces fongiques toxinogènes a été réalisée par des méthodes microscopiques et moléculaires. La quantification de la flore fongique potentiellement toxinogène dans le millet perlé a été, par ailleurs, réalisée par PCR en temps réel.Les résultats ont montré la co-occurrence d’une multitude de mycotoxines et de métabolites secondaires dans 91,4% des échantillons. Sur un nombre total de 57 métabolites détectés, les métabolites de Fusarium, d’Alternaria et d’Aspergillus représentaient 15,8%, 19,2% et 8,7%, respectivement, dont 10,5% (n=6) sont des mycotoxines majeures réglementées et 21% (n=12) des mycotoxines émergentes non réglementées. Notre étude a révélé une contamination importante du millet par les mycotoxines émergentes, notamment, les mycotoxines de Fusarium telles que la beauvericine (BEA), l'équisétine (EQUS), le monoacétoxyscirpénol (MAS) et le diacétoxyscirpénol (DAS) qui ont été détectés dans 43,2%, 43,2%, 11,4% et 10,5% des échantillons, respectivement. En outre, 12,7%, 50,9%, 53,2% et 14,1% des grains étaient contaminés par des mycotoxines d’Alternaria, à savoir l'alternariol (AOH), l'alternariolmonométhyl éther (AME), la tentoxine (TEN) et l'acide ténazonique (TA), respectivement. Parmi les mycotoxines majeures, l’aflatoxine B1 (AFB1) et l’ochratoxine A (OTA) étaient les plus répandues avec une fréquence de contamination modérée de 8,6% chacune. Cependant, tous les échantillons étaient contaminés à des teneurs dépassant les seuils limites autorisés allant de 12,2 à 1046 µg/kg et de 16,2 à 231 µg/kg pour l’AFB1 et l’OTA, respectivement. La fréquence et les niveaux de contamination par ces deux mycotoxines étaient aussi importants dans les échantillons collectés en post-récolte qu’en post-stockage.L’étude mycologique de la flore fongique potentiellement toxinogène sur le millet a montré la prédominance des genres Fusarium et Alternaria par rapport au genre Aspergillus. En outre, A. flavus a été identifiée comme la principale espèce responsable de la contamination du millet tunisien par les aflatoxines. Pour le genre Fusarium, les F. semitectum et F. equiseti sont les espèces les plus dominantes dans le millet. La prévalence des espèces A. alternata et A. tenuissima suivies par les A. arborescence et A. infectoria dans le genre Alternaria a été notée. La prolifération des champignons potentiellement toxinogènes et la contamination par les mycotoxines dans le millet semble avoir été influencées par les conditions climatiques et environnementales des différentes zones agroécologiques étudiées. Ainsi, le millet issu de la zone CT.N (Kelibia et Haouaria), doté d’un climat sub-humide, semble plus contaminé par des Alternaria et Fusarium spp. et par la majorité des mycotoxines émergentes de Fusarium (BEAU, DAS, EQUS et MAS) et d’Alternaria (AOH, AME, MAC et TEN). En revanche, le millet issu de la zone côtière sud (Zarzis) et la zone continentale centrale (Kairouan) s’avère plus susceptible à la contamination par les Aspergillus spp. et ainsi par l’AFB1 et l’OTA. Par ailleurs, les résultats ont montré que la qPCR a assuré une détection et une quantification plus précise et précoce de la flore fongique que l’approche microbiologique conventionnelle qui s’avère plus fastidieuse et classique.

The purpose of the present study is to draw up a complete profile of mycotoxins and toxigenic fungal species occurring in the Tunisian pearl millet (Pennisetum glaucum (L) R.Br.). Investigations were carried out on a total of 220 samples collected from farmers (n = 144) located in different agroecological zones of Tunisia and from retail shops (n = 76) using the multi-analyte method by LC/ESI-MS/MS. Fungal isolation was based on the direct plating method while the identification of toxigenic fungal species was carried out by the microscopic and molecular methods. The quantification of the potentially toxigenic fungal flora in pearl millet was carried out by quantitative real-time PCR assays.Results revealed the co-occurrence of a broad spectrum of mycotoxins and secondary metabolites contaminating 91.4% of grains samples. Out of a total number of 57 metabolites detected, and incidence of 15.8%, 19.2%, 8.7% of Fusarium, Alternaria and Aspergillus metabolites were, respectively, detected of which 10.5% (n=6) were reported as major regulated mycotoxins and 21% (n=12) as emerging unregulated mycotoxins.Our study revealed the prevalence of the emerging mycotoxins in the Tunisian pearl millet namely the occurrence of Fusarium mycotoxins, including beauvericin (BEA), equisetin (EQUS), monoacetoxyscirpenol (MAS) and diacetoxyscirpenol (DAS) in 43.2%, 43.2%, 11.4% and 10.5% of the samples, respectively. In addition, 12.7%, 50.9%, 53.2% and 14.1% of the grains were contaminated with Alternaria mycotoxins, namely alternariol (AOH), alternariolmonomethyl ether (AME), tentoxin (TEN) and tenazonic acid (TA), respectively. Regarding major mycotoxins, aflatoxin B1 (AFB1) and ochratoxin A (OTA) were the most prevalent at a moderated rate of 8.6% each. However, high levels ranging from 12.2 to 1046 µg/ kg and from 16.2 to 231 µg/kg for AFB1 and OTA were, respectively, detected. The frequency and contamination levels by these two mycotoxins were important in post-harvest as well as in post storage samples.The mycological study of the potentially toxigenic fungi showed a predominance of the genera Fusarium and Alternaria comparing to the Aspergillus genus. In addition, the results revealed that A. flavus is considered as the main species responsible for the AFB1 contamination in the Tunisian pearl millet. As regards the genus Fusarium, F. semitectum and F. equiseti are the most dominant species in millet. As concern Alternaria genus, results showed the prevalence of A. alternata and A. tenuissima followed by A. arborescence and A. infectoria. The proliferation of potentially toxigenic fungi and contamination by mycotoxins in millet were influenced by the geographic location as well as the climatic and environmental conditions across the different agroecological zones. Thus, millet from the CT.N zone (Kelibia and Haoua<ria), which has a sub-humid climate, seems more contaminated with Alternaria and Fusarium spp. and therefore by the majority of emerging mycotoxins from Fusarium (BEAU, DAS, EQUS and MAS) and Alternaria (AOH, AME, MAC and TEN). On the other hand, the millet from the southern coastal zone (Zarzis) and the central continental zone (Kairouan) is more susceptible to contamination by Aspergillus spp. and consequently by AFB1 and OTA.Otherwise, results showed that qPCR ensured a more precise and earlier detection and quantification of the fungal flora than the conventional microbiological approach which turns out to be more tedious and classic.