Caractérisation structurale des fibrilles amyloïdes par RMN à l'état solide

Structural characterization of amyloid fibrils by solid-state NMR

• Auteur / Autrice : Jayakrishna Shenoy Krishnashenoy Padmabai
• Direction : Antoine Loquet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie Physique
• Date : Soutenance le 11/12/2020
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (Bordeaux ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Erick Joël Dufourc
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Antoine Loquet, Erick Joël Dufourc, Salvador Ventura, Vinesh Vijayan, Alexander Kai Büll, Philippe Derreumaux
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Salvador Ventura, Vinesh Vijayan
• DOI : 10.70675/75b3a59ez2c1ez4544z86e3z8840a9bdd7b2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Neuropathies amyloïdes familiales

Résonance magnétique nucléaire

Mots clés libres

SSNMR

TDP-43

Amyloïdes

Beta−solénoïde

HET-s

NWD2

Thioflavin-T

SSNMR

TDP-43

Amyloids

Beta−solenoid

HET-s

NWD2

Thioflavin-T

Résumé

Projet 1- Dissection structurelle de fibrilles amyloïdes de différentes constructions TDP-43 par RMN à l'état solide. La protéine de liaison à l'ADN TAR de 43 kDa (TDP-43) est observée comme le principal composant des inclusions cytoplasmiques des cellules de patients souffrants de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et de la démence lobaire frontotemporale (DLF). La protéine TDP-43 se compose d'un domaine N-terminal (NTD) possédant une structure définie, de deux domaines de motifs de reconnaissance de l'ARN (RRM1 et RRM2) et d'un domaine C-terminal intrinsèquement désordonné (CTD). Le domaine C-terminal de type prion contient la plupart des mutations pathologiques pertinentes aujourd’hui connues et joue un rôle essentiel dans l'agrégation spontanée de TDP-43 et de la pathologie associée. Nous avons utilisé une combinaison de microscopie électronique, de diffraction des rayons X, d'analyse par spectroscopie infrarouge (par Transformée de Fourier) et de spectroscopie RMN des solides pour étudier l'organisation moléculaire de différents fragments de TDP, à savoir le TDP-43 complet, deux fragments C-terminaux (TDP-35 et TDP-16) et un fragment C-terminal tronqué (TDP-43 ∆GaroS2) dans leur état fibrillaire. Bien que les différentes constructions protéiques présentent une morphologie fibrillaire similaire et une signature typique de cross-β par diffraction des rayons X, les expériences de RMN des solides indiquent que TDP-43 et TDP-35 partagent la même structure moléculaire polymorphe. En même temps, la protéine tronquée TDP-16 comprend un noyau amyloïde bien ordonné. Nos résultats démontrent que les fragments C-terminaux peuvent adopter une conformation moléculaire différente, indépendamment ou dans le contexte de l'assemblage complet, ce qui suggère que les domaines N-terminaux et RRM jouent un rôle essentiel dans la transition amyloïde de la protéine TDP-43. Les études par RMN des solides des isoformes TDP-43 (sTDP43-1, sTDP43-2) responsables des sous-types de la SLA démontrent que ces isoformes peuvent former des amyloïdes sans le CTD et adopter un pli amyloïde similaire à TDP-43 complet, suggérant un mécanisme de repliage non-correct des domaines NTD et RRM responsables de la transition amyloïde dans les isoformes TDP43.Projet 2- Mécanisme moléculaire des protéines de signalisation amyloïdes hétérotypiques NWD2/HET-s impliquées dans la mort cellulaire programmée chez les champignonsLe prion [Het-s] active la protéine HET-S formant des pores et déclenchant la mort cellulaire programmée (PCD) chez le champignon Podospora anserina. La structure de type solénoïde de HET-s sert de modèle pour la transition amyloïde du domaine de formation du prion HET-S (PFD). Une protéine de la famille des récepteurs de type Nod-like (NLR) appelée NWD2, codée par le gène voisin de het-S, possède un motif N-terminal (R0) homologue à l'unité répétitive élémentaire de la structure b-solénoïde de HET-s (R1, R2). Les NLR sont associés à la défense de l'hôte et à la mort cellulaire programmée chez les plantes, les animaux et les champignons. Lors de l'activation, le motif N-terminal (R0) peut adopter la conformation solénoïde, servir de modèle à la transition amyloïde du domaine HET-S formant le prion, et déclencher la voie de mort cellulaire en aval. Dans ce travail, nous avons déduit la structure à résolution atomique adoptée par l'amyloïde fonctionnelle NWD2 (R0) en utilisant la RMN des solides. Nous avons également montré que le mécanisme de modélisation impliquant NWD2 et HET-S est obtenu par la formation d'une interface amyloïde hétérotypique via R0/R2, suivie par la PCD.

Project 1- Structural dissection of amyloid fibrils of different TDP-43 constructs by solid-state NMRThe TAR DNA binding protein of 43 kDa (TDP-43) is observed as the main component in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal lobar dementia (FTLD) cytoplasmic inclusions. TDP-43 consists of a well-folded N-terminal domain (NTD), two RNA recognition motif domains (RRM1 and RRM2) and an intrinsically disordered C-terminal domain (CTD). The prion-like C-terminal domain possesses most of the pathologically relevant mutations and plays a critical role in the spontaneous aggregation of TDP-43 and associated proteinopathy. We used a combination of electron microscopy, X‐ray fiber diffraction, Fourier‐transform infrared spectroscopy analysis, and solid‐state NMR spectroscopy to investigate the molecular organization of different TDP construct namely full-length TDP-43, two C-terminal fragments (TDP-35 and TDP-16) and a C-terminal truncated fragment (TDP-43 ∆GaroS2) in their fibrillar state. Although the different protein constructs exhibit similar fibril morphology and a typical cross-β signature by X-ray diffraction, solid-state NMR indicates that TDP-43 and TDP-35 share the same polymorphic molecular structure. At the same time, TDP-16 encompasses a well-ordered amyloid core. Our findings demonstrate that C-terminal fragments can adopt a different molecular conformation in isolation or the context of the full-length assembly, suggesting that the N-terminal and RRM domains play a critical role in the TDP-43 amyloid transition. ss-NMR studies of TDP-43 isoforms (sTDP43-1, sTDP43-2) responsible for ALS subtypes demonstrate that these isoforms can form amyloids without the CTD and adopt an amyloid fold similar to full-length TDP-43, suggesting a misfolding mechanism of NTD and RRM domains responsible for the amyloid transition in TDP43 isoforms.Project 2- Molecular mechanism of heterotypic amyloid signaling proteins NWD2/HET-s involved in Programmed cell death in fungiThe [Het-s] prion activates HET-S pore-forming protein and triggers programmed cell death (PCD) in the fungus Podospora anserina. The HET-s -solenoid fold act as a template for the amyloid transition of the HET-S prion-forming domain (PFD). A Nod-like receptor (NLR) protein called NWD2, encoded by the gene next to het-S possesses an N-terminal motif (R0) homologous to the elementary repeat unit of HET-s b-solenoid fold (R1, R2). The NLRs are associated with host defense and programmed cell death in plants, animals, and fungi. Upon activation, the N-terminal motif (R0) can adopt the b-solenoid fold, template the amyloid transition of the HET-S prion-forming domain, and trigger the downstream cell death pathway. In this work, we deduced the atomic resolution structure of the b-solenoid fold adopted by the functional amyloid NWD2 (R0) using solid-state NMR. Also, we showed that the templating mechanism involving NWD2 and HET-S achieved by the formation of a heterotypic amyloid interface via R0/R2, followed by PCD. Ss-NMR restraints determined an atomic-resolution structure of the heterotypic amyloid interface R0/R2.