Voies de signalisation activées lors de la stimulation du récepteur de l'apéline, responsables de l'effet hypotenseur de l'apéline
par Rodrigo Alvear-Perez
Thèse de doctorat en Pharmacologie
Sous la direction de Catherine Llorens-Cortes.
Soutenue le 29-01-2019
à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Université Paris Descartes (1970-2019) (établissement de préparation) .
Le président du jury était Michel Vidal.
Le jury était composé de Michel Vidal, Philippe Valet, Gilles Guillon, Nicolas Chartrel, Alain Berdeaux.
Les rapporteurs étaient Philippe Valet, Gilles Guillon.
- Apéline
- Beta-Arrestine
- Inhibiteurs d'internalisation
- Effet hypotenseur de l'apéline
- Apeline -- Récepteurs
- Bêta-arrestines
- Artérioles
- Bêta-arrestines
- Insuffisance cardiaque -- Thérapeutique
mots clés
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Résumé
L'apéline est un neuropeptide vasoactif qui joue un rôle crucial dans le maintien de l'équilibre hydrique et des fonctions cardiovasculaires. Des études réalisées au laboratoire sur les effets de l'apéline-17 (K17F) et du fragment d'apéline K16P, correspondant à K17F delétée de la phénylalanine (Phe) à son extrémité C-terminale, ont montré que la présence de cette Phe est nécessaire pour que l'apéline puisse d'une part, induire l'internalisation du récepteur de l'apéline, et d'autre part, provoquer une baisse de la pression artérielle. Par la suite, nous avons identifié dans les cellules CHO, exprimant de façon stable le récepteur murin de l'apéline que l'internalisation du récepteur de l'apéline induite par K17F avait pour conséquence d'induire l'activation d'une seconde voie de signalisation indépendante de la protéine Gi et dépendante de la beta-arrestine, correspondant à la voie des MAP kinases (Mitogen Activator Protein Kinase), qui pourrait être impliquée dans l'effet hypotenseur de l'apéline. Mes travaux ont ensuite consisté à caractériser dans un modèle physiologique, les artérioles afférentes juxtamédullaires de rein de rat (AAJM), si la voie de signalisation médiée par la beta-arrestine était impliquée dans l'effet vasodilatateur de K17F. Sachant que l'AngII induit une vasoconstriction en augmentant la mobilisation de calcium intracellulaire ([Ca2+]i), nous avons montré en mesurant les variations de diamètre artériolaire et de [Ca2+]i, que lorsque la voie Gi est bloquée par la toxine de pertussis (PTX), l'effet vasorelaxant induit par K17F n'est pas modifié. Ces données suggèrent que l'effet vasorelaxant de K17F sur les AAJM précontractées par l'AngII est protéine Gi-indépendant. En présence de PTX et de différents inhibiteurs d'internalisation, l'effet vasorelaxant induit par K17F sur les AAJM pré-contractées par l'AngII est aboli. De plus, en présence de PTX et de ces inhibiteurs, lorsque l'on applique K17F sur la phase plateau de la réponse calcique induite par l'AngII, aucune diminution significative de la mobilisation du [Ca2+]i est observée. Ceci est en accord avec notre hypothèse, à savoir que l'effet vasorelaxant de K17F est protéine Gi-indépendant et beta-arrestine-dépendant. L'ApélineR constitue une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de l'insuffisance cardiaque et des rétentions hydriques. Sachant que la demi-vie de l'apéline dans la circulation sanguine est de l'ordre de la minute, un autre volet de mon travail de thèse a été de développer des analogues de K17F métaboliquement stables par deux stratégies différentes. Premièrement, nous avons substitué chacun des résidus de l'apéline par son énantiomère de la série D ou par un acide aminé synthétique. Deuxièmement, nous avons ajouté une chaîne fluoroalkyle à l'extrémité N-terminale de K17F. Ces deux stratégies nous ont permis d'obtenir plusieurs composés dont les plus actifs sont le P92 et le LIT01-196 qui conservent des propriétés pharmacologiques identiques à celles de K17F et qui présentent une demi-vie plasmatique largement supérieure à celle du peptide endogène. Ces deux analogues se sont révélés actifs in vivo avec une capacité à diminuer la pression artérielle et à réduire la sécrétion de vasopressine dans le sang conduisant à une augmentation de la diurèse aqueuse.
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Titre traduit
Signalling pathways activated by apelin receptor stimulation and responsible of the hypotensive effect of apelin.
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Résumé
Apeline is a vasoactive neuropeptide which plays a crucial role in maintaining water balance and cardiovascular functions. Laboratory studies on the effects of Aperlin-17 (K17F) and the K16P apelin fragment, corresponding to K17F deletion from phenylalanine (Phe) at its C-terminal part have shown the presence of this Phe is necessary for apelin to induce internalization of the Apelin receptor. Also cause a decrease in blood pressure. Subsequently, in the CHO cells expressing stably the murine receptor of the Apelin that the internalization of the Apelin receptor induced by K17F resulted in the activation of a second signaling pathway which is independent of the Gi protein, but dependent on beta-arrestin. This corresponds to the MAP kinase pathway (Mitogen Activator Protein Kinase), which could be involved in the hypotensive effect of the Apelin. My work consisted of characterizing a physiological model such as the rat kidney juxtamedullary afferent arterioles (JMAA), to study if the signaling pathway mediated by beta-arrestin was involved in the vasodilatory effect of K17F. Knowing that AngII induces vasoconstriction by increasing intracellular calcium mobilization ([Ca2+]i), we have showed by measuring variations in arteriolar diameter and [Ca2+]i, that when the Gi signaling pathway is blocked by pertussis toxin (PTX), the vasorelaxant effect induced by K17F is not modify. This data suggests that the vasorelaxing effect of K17F on AngII pre-contracted JMAAs is Gi-independent protein. In the presence of PTX and various internalization inhibitors the vasorelaxant effect induced by K17F on AngII-pre-contracted JMAAs is completely blocked. In addition, no significant decrease in [Ca2+]i mobilization is observed in the presence of PTX and these inhibitors, when K17F is applied to the plateau phase of the AngII-induced calcium response. This is in line with our hypothesis, that the vasorelaxing effect of K17F is Gi-independent protein and beta-arrestin-dependent. ApelineR is a potential therapeutic target for the treatment of heart failure and water retention. Knowing that the half-life of the aperitif in the bloodstream is approximatly one minute. Another aspect of my thesis was to develop metabolically stable K17F analogues by two different strategies. First, we have substituted each of the residues of the aperitif with its D-series enantiomer or a synthetic amino acid. Secondly, we added a fluoroalkyl chain to the N-terminal end of K17F. These two strategies have enabled us to obtain several compounds, the most active of which are P92 and LIT01-196. These retain pharmacological properties identical to those of K17F and have a plasma half-life significantly higher compared to the endogenous peptide. These two analogues have been shown to be active in vivo with the ability to reduce blood pressure and reduce vasopressin secretion in the blood leading to an increase in aqueous diuresis.
