Interaction entre les virus influenza et la machinerie d'épissage cellulaire

Interplay between influenza viruses and the cellular splicing machinery

• Auteur / Autrice : Usama Ashraf
• Direction : Nadia Naffakh
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé. Microbiologie
• Date : Soutenance le 20/11/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de génétique moléculaire des virus à ARN (Paris ; 2008-2022)
• Jury : Président / Présidente : Pierre-Emmanuel Ceccaldi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nadia Naffakh, Pierre-Emmanuel Ceccaldi, Daniel Marc, Panagiotis Papasaikas, Ronan Le Goffic, Sylvie Van der Werf
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Daniel Marc, Panagiotis Papasaikas

Mots clés

Mots clés contrôlés

Séquençage des acides nucléiques

Virus à ARN

Immunothérapie adoptive

Épissage (génétique)

Influenzavirus A

Mots clés libres

RED-SMU1

Résumé

A la différence de la plupart des virus à génome ARN, les virus influenza se répliquent dans le noyau des cellules infectées, et ont développé une expansion de la capacité de codage de leur génome par le biais de l’épissage de certains de leurs ARN messager (ARNm). Pour les virus influenza de type A (IAV), il a été montré que des interactions physiques et fonctionnelles entre des protéines virales et des facteurs d’épissage cellulaire régulent étroitement l’épissage des ARNm viraux, et sont essentielles à la réplication virale. Une analyse plus poussée des interactions entre IAV et épissage cellulaire devrait contribuer à une meilleure connaissance des mécanismes de régulation de l’expression des gènes viraux, et du réseau complexe des interactions entre virus influenza et cellule hôte. Elle pourrait également conduire à l’élaboration de nouvelles thérapies thérapeutiques permettant de surmonter la principale limitation des antiviraux actuellement disponibles, à savoir l’émergence rapide et fréquente de virus pharmacorésistants.Dans ce cadre nous nous sommes fixé deux objectifs: (i) explorer le potentiel de molécules déstabilisatrices du complexe d’épissage RED-SMU1 humain pour le traitement des infections grippales; et (ii) caractériser, à l'échelle du transcriptome, les altérations des évènements d'épissage cellulaire induites par l’infection grippale. Sur la base de données antérieures démontrant que le complexe d’épissage RED-SMU1 est essentiel à l’épissage de l’ARNm NS1 des IAV et à la multiplication virale, nous avons cherché à identifier des composés capables de déstabiliser le complexe RED-SMU1, et par conséquent d’inhiber la réplication des IAV. À cette fin, nous avons collaboré avec des experts en biologie structurale (T. Crépin, IBS Grenoble), et en modélisation moléculaire et chimie médicinale (N. Pietrancosta, Université Paris Descartes). Nous avons commencé par confirmer expérimentalement les données de structure cristalline tridimensionelle d'un complexe RED-SMU1 minimal, composé du domaine N-terminal de SMU1 (acides aminés 1 à 196) et d’un court domaine médian de RED (acides aminés 206 à 260). Pour ce faire nous avons combiné un test d’interaction RED-SMU1 en cellules 293T, basé sur la trans-complémentation de deux sous-domaine de la luciférase de Gaussia princeps (« split-luciferase ») fusionnés l’un à RED et l’autre à SMU1, avec de la mutagenèse dirigée. Puis la structure du complexe RED-SMU1 minimal a servi de base criblage in silico d’une chimiothèque de 4121 composés, à la recherche de molécules capable de rentrer en compétition avec RED pour la liaison à SMU1. A l’issue d’un premier criblage, nous avons procédé à l’évaluation expérimentale de 16 molécules sélectionnées in silico. Leur toxicité, leur capacité à réduire le signal d’interaction RED-SMU1 dans le test de trans-complémentation « split-luciferase », et leur capacité à inhiber la réplication d’un IAV recombinant porteur d’un gène rapporteur Nanoluc, ont été déterminées. Parmi les 3 composés présentant les meilleures performances, le composé LSP641 a été co-cristallisé avec le domaine N-terminal de SMU1 par notre collaborateur T. Crépin.

Influenza A viruses (IAVs) replicate in the nucleus of infected cells, which provides access to the cellular splicing machinery. Physical and functional interactions between viral proteins and cellular splicing factors have been shown to tightly regulate the splicing some of IAV mRNAs, and to be essential for viral replication. Further analysis of the interplay between IAVs and cellular splicing will provide new insights into the complex network of IAV-host cell interactions. It may also lead to the development of new anti-influenza strategies that may overcome the major limitation of existing drugs, i.e. the rapid and frequent emergence of drug-resistant viruses. Based on previous data showing that the RED-SMU1 splicing complex is essential for IAV replication, we sought to identify compounds that disrupt the RED-SMU1 complex and therefore inhibit IAV replication. To this end, we collaborated with experts in structural biology and molecular modeling/medicinal chemistry. We validated the 3D crystal structure of a minimal RED-SMU1 complex by mutagenesis experiments. Upon two rounds of in silico screening of a library of 4,121 compounds, followed by experimental evaluation, we identified two synthetic molecules that target an alpha-helix/groove interface essential for RED-SMU1 assembly. One of these molecules was co-crystallized with the N-terminal domain of SMU1. We showed that these compounds inhibit RED-SMU1 interaction, decrease endogenous RED-SMU1 levels, and inhibit viral mRNA splicing and viral multiplication, whilst preserving cell viability. Altogether, our data demonstrate the potential of RED-SMU1 destabilizing molecules as a novel host-targeted therapy, which could be active against a wide range of IAVs and be less prone to drug resistance. In parallel, we sought to investigate IAV-induced perturbations of cellular alternative splicing events (ASEs) at a transcriptome-wide level, an aspect of IAV biology which has not yet been explored in-depth. To this end, we collaborated with a team of bioinformaticians with a special expertise in the analysis of cellular ASEs. HiSeq Illumina sequencing of polyA+ RNAs isolated from mock- or IAV-infected A549 cells was performed. We analyzed ASEs using a software which does not rely on existing splice site annotations and therefore can identify so far uncovered splicing events, and we performed an integrated analysis of splicing events, fold-change expression, and termination readthrough. We identified 3,969 ASEs (exon skipping, intron retention, alternative donor or acceptor sites, and multiple exon skipping), corresponding to 2,079 genes, that show a marked and significant difference in splicing upon IAV infection. Our analysis points to a global increase of exon inclusion and decrease in intron retention in IAV-infected cells. Viral-induced alterations of the cellular splicing appeared to be largely independent from the viral-induced changes in gene expression and termination readthrough. Gene ontology analysis revealed that RNA metabolism, signaling pathways, and biosynthetic processes are represented among the top 10 biological processes associated with differentially spliced genes. The high rate of validation of a selected subset of 32 differentially regulated ASEs using the orthogonal RT-PCR method demonstrated the robustness of our experimental settings and bioinformatics analysis. Further analyses on a subset of 9 ASEs showed that the observed splicing alterations are highly conserved across two human respiratory cell lines, and largely shared between two distinct IAVs. These observations open the way to functional studies, which in the long term may reveal new mechanisms through which IAVs rewire cellular gene expression to promote viral replication or to limit the antiviral response.