Mise en évidence et caractérisation de la flagellation chez les bactéries segmentées filamenteuses de l'intestin

Demonstration and characterization of flagellation in intestinal segmented filamentous bacteria

• Auteur / Autrice : Iris Nkamba
• Direction : Nadine Cerf-Bensussan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 04/11/2019
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Claude-Agnès Reynaud
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Claude-Agnès Reynaud, Jean-Claude Sirard, Imad Kansau, Annaïg Lan, Mathieu Picardeau
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Claude Sirard, Imad Kansau

Mots clés

Mots clés contrôlés

Flagelles (biologie)

Intestins

Bactéries

Mots clés libres

Microbiote

Bactéries segmentées filamenteuses

SFB

Intestin

Flagelle

TLR5

Flagelline

Microbiota

Segmented filamentous bacteria

SFB

Intestine

Flagella

TLR5

Flagellin

Résumé

Présentes dans l'intestin de nombreuses espèces vertébrées, y compris chez l'homme et la souris, les bactéries segmentées filamenteuses (SFB en anglais) jouent un rôle capital dans la maturation du système immunitaire. Ces bactéries commensales très particulières sont capables d'adhérer à l'épithélium intestinal et de ce fait sont de puissants inducteurs du développement des tissus lymphoïdes ainsi que l'immunité adaptative. L'état d'inflammation physiologique ainsi engendré participe à protéger l'hôte contre pathogènes intestinaux ou extraintestinaux mais dans certains modèles murins de maladies auto-immunes, il peut aussi aggraver la sévérité de la pathologie. Malgré l'importance potentielle des SFB pour le domaine médical, les mécanismes uniques de colonisation de l'intestin et de régulation du système immunitaire sont mal connus, principalement car les SFB ne sont cultivables que depuis peu et qu'il s'agit encore aujourd'hui une procédure compliquée. Le modèle actuel du cycle de vie des SFB décrit d'abord l'adhésion d'une bactérie unicellulaire à l'épithélium intestinal, sa croissance en un filament suivie de segmentations successives et enfin sa différentiation pour produire de nouvelles SFB unicellulaires et répéter le cycle. De manière surprenante, le séquençage du génome de SFB a révélé un ensemble complet de gènes de biosynthèse des flagelles mais leur présence n'avait jusqu'alors jamais été observée chez les différentes souches de SFB testées, et la flagelline jamais détectée dans les fèces de souris mono-colonisées. Nous avons réussi à mettre en évidence la présence de flagelle au stade unicellulaire des SFB. En améliorant les techniques de purification classiquement utilisées, nous avons d'abord identifié des peptides de flagelline par spectrométrie de masse dans les fèces de souris monocolonisées et montré qu'une des quatre flagellines des SFB était bien plus exprimée que les autres. Des images de microscopie électronique de SFB de rat ou de souris purifiées d'intestin de souris mono-colonisées nous ont ensuite permis d'observer que seul le stade unicellulaire de SFB était flagellé. Grâce à un système de culture in vitro précédemment développé au laboratoire, nous avons enfin montré que ces flagelles sont formés avant la libération des SFB unicellulaires de l'extrémité du filament, qu'ils sont fonctionnels et rendent la bactérie motile, et que ces SFB nouvellement formées peuvent stimuler le système immunitaire via le TLR5. En conclusion, ces résultats ajoutent un chaînon manquant à notre compréhension du cycle de vie des SFB et soutiennent l'hypothèse d'un rôle de la détection du flagelle par l'hôte dans la puissante stimulation du système immunitaire qu'induit SFB.

Found in the gut of many vertebrates including mice and humans, Segmented Filamentous Bacteria (SFB) are key modulators of the maturation of the intestinal immune system. These unusual commensals intimately attach to the ileal epithelium and, through this adhesion, potently stimulate lymphoid tissue development as well as the host innate and adaptive immune system. The physiological inflammation thus created protects the host from pathogens in and outside the gut but can also exacerbate disease severity in several murine autoimmune models. Despite its potential medical importance, little is known on the unique mechanisms of SFB colonization and immune regulation, mainly because SFB has resisted in vitro culture for fifty years and is still difficult to cultivate. The current model of the complex lifecycle of SFB describes attachment of teardrop-shaped unicellular SFB to the epithelium, growth into filaments followed by successive rounds of division and differentiation to finally produce new unicellular SFB. Unexpectedly, a full set of flagellar biosynthesis genes was found in SFB genome whereas flagella were never observed on SFB in various host species, and flagellin protein never detected in feces of SFB monocolonized mice. We have now shown that the unicellular stage of SFB is flagellated. First, using gentle but thorough purification techniques coupled with mass spectrometry, we were able to find flagellin peptides in purified SFB samples, and show by qPCR that one of SFB four flagellins was much more expressed that others. Transmission electron microscopy of rat and mouse SFB purified from the intestinal content of monoassociated mice revealed that flagella are unique to the unicellular stage and always emanate from the pointed tip that mediates attachment to the epithelium. Using an in vitro SFB growth system developed in the lab, we showed that flagella are formed prior to the release of unicellular SFB from the filament end, that they are perfectly functional and confer motility to the bacterium, and that these newly formed SFB can stimulate the TLR5 immune pathway. In conclusion, these findings add a missing link to our understanding of the SFB lifecycle and give support for a potential role of flagella sensing by the host in the potent immunostimulation SFB induces.