Role du confinement sur l'endocytose dépendante de la clathrine

Role of Confinement on Clathrin-mediated Endocytosis

• Auteur / Autrice : Dahiana Le devedec
• Direction : Guillaume Montagnac
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 17/09/2019
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Hématopoïèse normale et pathologique (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-2019)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Thomas Mercher
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Guillaume Montagnac, Thomas Mercher, Cédric Delevoye, Danijela Vignjevic, Mark G. H. Scott
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Cédric Delevoye, Danijela Vignjevic

Mots clés

Mots clés contrôlés

Clathrine

Contrainte mécanique

Tumeurs précoces

Récepteurs du facteur de croissance épidermique

Endocytose

Mots clés libres

Endocytose frustrée

Clathrine

Confinement

Récepteur à l'EGF

Hb-Egf

Frustrated endocytosis

Clathrin

Confinement

Egfr

Hb-Egf

Résumé

L’endocytose dépendante de la clathrine (EDC) est la principale voie d’internalisation des récepteurs de surface et de leurs ligands. L’internalisation se fait suite à l’invagination de la membrane plasmique vers l’intérieur de la cellule suite à la formation, dans un premier temps, de puits recouverts de clathrine (PRCs) qui bourgeonnent ensuite en vésicules recouvertes de clathrine dans le cytosol. L’EDC est un processus très dynamique qui a lieu en l’espace de 30 sec-1mn. Elle est impliquée dans de multiples fonctions et permet ainsi à la cellule de réguler l’expression de ses protéines en surface, de répondre aux signaux de prolifération ou migration envoyés par l’environnement immédiat via l’activation de voies de signalisation spécifiques ou encore de réguler le renouvellement des composants de la membrane plasmique. De par son importance, des dérégulations de l’endocytose dépendante de la clathrine ont déjà été observées dans les cancers. Ces modifications peuvent impliquer directement l’EDC en modifiant ses composants ou indirectement lors d’altérations de récepteurs régulés par celle-ci. La progression tumorale est elle-même régulée par de multiples facteurs, notamment l’accumulation de mutations qui ont des conséquences sur les cellules cancéreuses elle-même ou bien sur l’environnement immédiat, formant ainsi la « niche tumorale ». Ces changements agissent réciproquement sur la progression tumorale afin de l’amplifier. Lors de la croissance tumorale, les cellules cancéreuses recrutent des fibroblastes qui vont participer au remodelage et à l’augmentation de la rigidité autour de la tumeur. La rigidité de la matrice extracellulaire est détectée par les cellules ce qui envoie des signaux déclencheurs de prolifération et de migration en conséquence. Cette détection passe essentiellement par les intégrines à la surface membranaire qui vont s’agréger et induire des cascades de signalisation impliquées dans ces réponses. Ces intégrines peuvent se regrouper dans deux types de structures, les adhésions focales et les structures recouvertes de clathrine. En ce qui concerne ces dernières, il a été démontré précédemment que la rigidité du substrat augmente sa force d’interaction avec les intégrines, et empêche ainsi l’internalisation des vésicules recouvertes de clathrine, on parle alors d’ « endocytose frustrée ». Cette rétention des structures recouvertes de clathrine à la surface provoque une signalisation soutenue à la surface au lieu de l’arrêter par dégradation ultérieure des récepteurs dans les lysosomes. Le laboratoire a démontré que les structures de clathrine frustrées capturent ainsi différent récepteurs conduisant à une signalisation accrue dans la voie de la MAP Kinase Erk. Mon projet de thèse repose sur ces observations en s’intéressant plus particulièrement au rôle d’une autre modification induite par la croissance tumorale, le confinement. En effet, en se multipliant de manière incontrôlée dans un environnement spatialement restreint, les cellules tumorales se retrouvent soumises à des forces de compression. Les résultats mis en évidence au cours de ma thèse ont montré que le confinement provoque, comme la rigidité, une frustration des structures de clathrine qui ne sont donc plus capables de soutenir l’endocytose des récepteurs. De plus, la compression cellulaire induit le clivage d’un pro-ligand de l’EGFR, le HB-EGF, ce qui conduit à l’activation paracrine de l’EGFR et à l’activation de la voie Erk. En effet, l’absence de facteurs de croissance dans le milieu ainsi que l’inhibition de ce clivage démontrent la nécessité de la mise en place de ce mécanisme. En résumé, le confinement induit le clivage du pro-ligand HB-EGF, qui à son tour va activer le récepteur à l’EGF. En parallèle, l’endocytose est ralentie et provoque une signalisation accrue à la membrane. Ces deux évènements coopèrent pour mener à une très forte activation de la voie Erk.

Clathrin-mediated endocytosis (CME) is the major route of endocytosis for many cargos in eukaryotic cells. Endocytosis takes place at clathrin-coated pits (CCPs), small assemblies of clathrin and clathrin adaptors randomly distributed at the plasma membrane. Clathrin polymerization induces the progressive bending of the plasma membrane resulting in the formation of a vesicle budding off into the cytosol. CME is a highly dynamic process with an average lifetime of CCPs in the order of 30 seconds. In this manner, CME fulfills a range of different functions and enables cells to regulate the surface expression of proteins, to sample the cell’s environment for growth and guidance cues, to control the activation of signaling pathways and to turn over membrane components by sending these components for degradation in the endo-lysosomal pathway. A deregulation of the endocytic pathways was previously shown to be involve in cancer. These modifications can affect CME directly by modifying its actors, or indirectly with mutations on receptors or cargoes undertaken by CME. Tumor progression is dependent of several factors, the first one involving the accumulation of mutations which results in modifications in the cells themselves or on their surrounding environment by changing its biochemical and physical properties, leading to the formation of the tumor niche. These changes reciprocally foster cancer progression. During tumor growth, fibroblasts will be recruited around tumor cells, leading to the remodeling of the microenvironment and to an increase of rigidity nearby the tumor. This stiffness is sensed by the cells and send signals for proliferation and migration as a result. Stiffness sensing engages mainly integrins at the cell surface which will aggregate and initiate signaling cascades accountable for these responses. Integrins are capable of clustering into two types of structures: focal adhesions and clathrin-coated structures (CCSs). Regarding CCSs, it was shown previously that high stiffness strengthen the interaction between integrins and the substrate, hence preventing the budding off of the vesicle, and this is referred to as “frustrated endocytosis”. This holding of CCSs at the cell surface promotes a sustained signaling at the plasma membrane instead of a signal termination after internalization and further degradation in lysosomes. My PhD project relied on these previous findings, with a particular focus on another mechanical alteration observed in tumors, the confinement. Indeed, during the uncontrolled proliferation of cancer cells in a spatially restricted area, cells become subjected to compressive forces. The results I obtained indicate that confinement leads to frustrated endocytosis and hence to sustained signaling from the plasma membrane. In addition, compression also leads to HB-EGF shedding at the cell surface, and the resulting EGF product activate the EGFR in a paracrine manner, thus leading to the activation of the MAP kinase Erk signaling pathway. Indeed, both the absence of EGFR ligands in the medium and the inhibition of the shedding demonstrate the necessity of this mechanism in EGFR activation. To sum up, confinement induces the shedding of the EGFR pro-ligand HB-EGF necessary to EGFR activation in these conditions. Simultaneously, endocytosis is delayed and frustrated endocytosis leads to sustained signaling at the cell surface. Together, these events cooperate to strongly activate the Erk pathway. These findings highlight the interplay between the physical feature of the tumor environment and signaling pathways known to govern tumor growth.