Définition de cibles potentielles dans le SST3 de Pseudomonas aeruginosa pour une nouvelle stratégie anti-infectieuse

Definition of potential targets in the Pseudomonas aeruginosa T3SS for a new anti-infectious strategy

• Auteur / Autrice : Tuan Dung Ngo
• Direction : Eric Faudry
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie microbiologie immunologie
• Date : Soutenance le 06/02/2019
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie du cancer et de l'infection (Grenoble ; 2010-2020)
• Jury : Président / Présidente : Bertrand Toussaint
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Eric Faudry, Thierry Vernet, Sophie Bleves
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Michel Jault, Ariel Blocker

Mots clés

Mots clés contrôlés

Infections à Pseudomonas aeruginosa

Mots clés libres

Infections

Complexes et interactions protéiques

Dépliement

Machinerie cellulaire

Pseudomonas aeruginosa

Infections

Protein complexes and interactions

Unfolding

Cellular machinery

Pseudomonas aeruginosa

Résumé

Caractérisation et inhibition du Système de Sécrétion de Type III de Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste gram-negatif qui cause des maladies nosocomiales et infecte les patients atteint de la mucoviscidose. Le Système de Sécrétion de Type III (SST3) est un de ses facteurs de virulence les plus importants et permet d’injecter directement quatre exotoxines dans les cellules hôtes. Une protéine très importante du SST3 est l’ATPase PscN qui est impliquée dans l’assemblage et le fonctionnement de ce système. Dans ce travail, nous mettons en évidence l’interaction de PscN avec des protéines sécrétées du SST3, avec leurs chaperonnes seul ou en complexes, en utilisant trois technique de ELISA, HTRF and MST. En particulier, la MST (Microscale Thermophoresis) nous a permis de déterminer les constantes de dissociation (Kd) entre ces protéines et PscN. Les résultats montrent que l’ATPase interagit préférentiellement avec les protéines sécrétées ou les complexes plutôt que les chaperonnes, ce qui confirme le fait que celles-ci sont libérées dans le cytoplasme bactérien après la dissociation des complexes. Par ailleurs, en évaluant le Kd entre des complexes d’effecteur, de translocateur ou d’aiguille et l’ATPase liée ou non au complexe « Gate-keeper », qui est connu comme un régulateur de sécrétion de protéines sécrétées par SST3, nous montrons que l’affinité de PscN avec le complexe de l’aiguille est considérablement augmentée en présence de ce régulateur. Ainsi, un nouveau rôle est assigné au complexe « Gate-keeper » dans la régulation de la sécrétion hiérarchique du SST3, en contrôlant le chargement du complexe de l’aiguille sur l’ATPase.En parallèle, nous avons ainsi l’opportuniste de caracteriser les effets ex vivo et in vivo de molécules identifiées dans un criblage antérieur in vitro en raison de leur capacité à inhibe l’interaction entre PscE et PscG. Ces deux protéines sont les deux chaperonnes cytoplasmiques de PscF, la protéine de l’aiguille du SST3. Cette interaction est une cible intéressante pour une stratégie anti-virulence car des simples ou doubles mutations ponctuelles dans l’interface d’interaction de PscE-PscG diminuent la virulence de P. aeruginosa. Ce travail met en avant les deux meilleures molécules « leads » dont la structure est très proches et qui appartiennent à un cluster hybride combiant les hits de deux libraries de molécules. Ces deux composés inhibent les dommages cellulaires causés par des souches de P. aeruginosa possédant le SST3, ne sont pas toxiques pour des cellules eucaryotes et ont un effet minimal sur la croissance, la mobilité et le métabolisme de la bactérie. De plus, ces « leads » peuvent améliorer considérablement la survie de Galleria mellonnela lors d’infection par P. aeruginosa.Mots clés: Pseudomonas aeruginosa, Système de Sécrétion de Type III, ATPase, Anti-virulence

Characterization and inhibition of Pseudomonas aeruginosa Type III Secretion SystemPseudomonas aeruginosa is a Gram-negative opportunistic pathogen that causes nosocomial diseases and infects cystic fibrosis patients. The Type III Secretion System (T3SS) is one of its most important virulence factors, allowing the direct injection of four exotoxins into the target eukaryotic cells. An important protein of T3SS is the conserved ATPase, named PscN that is involved in the assembly and functioning of this system. In this work, we demonstrated the interaction of PscN with T3SS secreted cargo proteins and with their chaperons in complex or alone using ELISA, HTRF and MST assays. Of important, MST (Microscale Thermophoresis) allowed us to determine the dissociation constants (Kd) of these proteins and PscN, showing the interaction preference of this enzyme for the cargo or complex proteins rather than for the corresponding chaperons alone. This confirm the hypothesis that the chaperons are released in the bacterial cytoplasm after the complex dissociation. Otherwise, we assess the Kd between the effector, translocator or needle complexes and PscN bound or not to the gate-keeper complex which is described as a regulator of substrate sorting for the secretion. The results showed that the binding of the gate-keeper to PscN dramatically increases its relative affinity for the needle complex, thus revealing a new role of the gate-keeper in the loading of the needle complex to the ATPase for the control of substrate hierarchical secretion in P. aeruginosa.In parallel, committed to the anti-virulence strategy, we take the opportunity to characterize the ex vivo and in vivo effects of compounds identified by a previous in vitro screening to inhibit the interaction of PscE and PscG. These proteins are the two cognate chaperons of the T3SS needle protein PscF in the bacterial cytoplasm. This interaction had been shown to be a valid anti-virulence target because single or double point mutations introduced within the binding site between PscE and PscG lead to a decrease of P. aeruginosa virulence. This work points out two best leads which belong to the structural hybrid cluster combining hits from two different chemical libraries. The two compounds inhibit the cell damages caused by T3SS positive P. aeruginosa strains, are non-toxic for eukaryotic cell and have minimal effect on bacterial fitness. They were also shown to be specific for T3SS and could protect Galleria mellonnela against P. aeruginosa infection.Key words: Pseudomonas aeruginosa, Type III Secretion System, ATPase, Anti-virulence