Cristallographie monochromatique résolue en temps au synchrotron d'un domaine de photorécepteur de plante

Time-resolved monochromatic synchrotron crystallography of a plant photoreceptor domain

• Auteur / Autrice : Sylvain Aumonier
• Direction : Antoine Royant, Gordon Leonard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 11/07/2019
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Structural Biology Group
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble, Isère, France ; 1992-....) - European synchrotron radiation facility (Grenoble, Isère, France ; 1988-....)
• Jury : Président / Présidente : Eva Pebay-Peyroula
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Antoine Royant, Pascal Arnoux, Lars-Oliver Essen, Arwen Pearson, Elspeth Garman
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pascal Arnoux, Lars-Oliver Essen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Radiocristallographie

Rayonnement synchrotron

Cristallographie

Mots clés libres

Cristallographie aux rayons X

Photorécepteur

Cristallographie résolue en temps

Cristallographie sérielle

Cristallogenèse

Domaine LOV

X-Ray crystallography

Photoreceptor

Time-Resolved crystallography

Serial crystallography

Crystallogenesis

LOV domain

Résumé

La cristallographie résolue dans le temps (TRX) permet l’identification à l’échelle quasi atomique des changements structuraux progressifs au sein d’une protéine lorsqu’elle réalise sa fonction, permettant la constitution de véritables films moléculaires. La diffraction Laue (polychromatique) dans les synchrotrons de 3ème génération a d’abord permis d’obtenir de tels films à une échelle de temps de 100 ps, et plus récemment les sources de rayons X de 4ème génération, les lasers à électrons libres (XFELs, pour X-Ray Free Electron Lasers), ont permis d’atteindre une résolution temporelle de 100 fs en utilisant un faisceau monochromatique. L’objectif de cette thèse était d’explorer la possibilité d’effectuer des expériences de TRX au synchrotron sur les lignes de lumière monochromatiques dédiées à la cristallographie macromoléculaire en tirant parti des tout derniers développements technologiques. Nous avons envisagé de travailler sur trois protéines photosensibles différentes, pour lesquelles j’ai dans un premier temps développé différentes stratégies de cristallogenèse afin de contrôler la taille et la forme des cristaux. J’ai également testé différentes façons d’exposer les cristaux au faisceau de rayons X à température ambiante, soit des cristaux uniques montés sur une boucle et maintenu dans un flux d’humidité contrôlée, soit des microcristaux incorporés dans un flux de graisse passant à travers le faisceau de rayons X. Nous avons ensuite évalué comment les dommages radiatifs spécifiques pouvaient affecter les structures d’état intermédiaires de protéines à température ambiante, espèces particulièrement sensibles à température cryogénique. Nous avons conclu de cette étude que le dommage radiatif spécifique constitue un bien moindre problème à température ambiante qu’à température cryogénique. Après une caractérisation initiale des différentes protéines et des moyens de présentation au faisceau, nous avons concentré notre approche de cristallographie résolue dans le temps sur des cristaux d’un domaine de photorécepteur de plante, AtPhot2LOV2 (le domaine LOV2 du récepteur à la lumière bleue phototropine-2 de la plante Arabidopsis thaliana). L’état initial de AtPhot2LOV2 se convertit en quelques microsecondes en un état de signalisation, ou état photo-activé, qui se relaxe en quelques centaines de secondes. En utilisant un détecteur rapide de rayons X, nous avons caractérisé structuralement le phénomène de relaxation, et montré qu’elle se développe en une vingtaine de minutes via une conversion de groupe d’espace. Nous avons ensuite diminué la vitesse de formation de l’état photo-activé dans les cristaux en limitant la quantité de photons nécessaires à la photoconversion, et nous avons pu visualiser l’augmentation progressive de la population en l’état photo-activé dans le cristal avec une résolution temporelle de 63 ms, en utilisant une approche basée sur l’enregistrement de données de diffraction sur moins de 100 cristaux et tirant parti de la combinaison de jeux de données partiels, approche que nous avons nommée TR-SOX (Time-Resolved Serial Oscillation Crystallography). En résumé, notre travail ouvre la voie aux expériences de cristallographie résolue dans le temps sur les lignes de lumières monochromatiques de cristallographie macromoléculaire au synchrotron, sur des cristaux de taille usuelle pour des protéines subissant des réarrangements structuraux à l’échelle de la milliseconde.

Time-resolved crystallography (TRX) enables the identification at a near atomic detail of the progressive structural changes of a protein fulfilling its function, thus leading to the establishment of genuine molecular movies. Laue (polychromatic) diffraction at 3rd-generation synchrotrons first managed to obtain such movies at a 100 ps time scale, and more recently, the 4th generation X-ray sources XFELs (X-ray Free Electron Lasers) achieved a 100 fs time scale using a monochromatic beam. The goal of this thesis was to investigate the possibility of performing TRX on a macromolecular monochromatic crystallography beamline, by taking advantage of the latest technological developments. We envisaged three different photosensitive proteins, for which I first developed various crystallogenesis strategies in order to control the size and shape of the crystals. I also considered various ways of presenting the crystals of the beam at room temperature, either a single crystal mounted in a loop and kept in a wet air stream, or microcrystals moving in a grease jet passing through the beam. We then investigated how specific radiation damage could affect the structures of intermediate states at room temperature, given how sensitive they can be at cryogenic temperature. We concluded that it constitutes a much lesser concern at room than at cryogenic temperature. After initial characterization of the various proteins and sample environments, we focused on a time-resolved crystallography approach on crystals of the plant photoreceptor domain AtPhot2LOV2 (the LOV2 domain of the blue-light photoreceptor photropin-2 from Arabidopsis thaliana). The dark state AtPhot2LOV2 converts in microseconds into the signalling state, or light state, which relaxes in hundreds of seconds. Using a fast pixel X-ray detector, we characterized the structural decay of the light state, and showed that it proceeds via a space group conversion over a 20 min time course. We then slowed down the rate of the light state in crystals by limiting the quantity of photons, and we were able to monitor the process of light state population build-up with a 63 ms time resolution using an approach recording full data sets on less than 100 crystals, which we called TR-SOX for time-resolved serial oscillation crystallography, which takes advantage of merging partial data sets. Overall, our work paves the way for time-resolved crystallography on MX monochromatic synchrotron beamlines on regular-sized crystals of proteins that undergo structural rearrangements on the millisecond time scale.